一种重组毕赤酵母工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种重组毕赤酵母工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域；在本发明专利技术中，利用基因工程手段，在P.pastoris GS115的基础上构建了协同表达6

【技术实现步骤摘要】
一种重组毕赤酵母工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种重组毕赤酵母工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]D
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阿拉伯糖醇是一种五碳糖醇，在食品和医药行业具有潜在用途，也是该行业某些化工产品的优质原料。由于具有类似蔗糖的甜味，热量值极低(0.2cal/g)，被消化道吸收代谢缓慢，D
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阿拉伯糖醇可作为潜在的低能量甜味剂和糖替代品用于糖尿病患者。此外，D
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阿拉伯糖醇可以转化为阿拉伯酸、丙二醇、木糖醇、木糖酸、等其他高附加值化学品，还可作为阿糖腺苷、阿糖胞苷和D
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葡萄糖苷酶抑制剂等药物的中间体。D
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阿拉伯糖醇的一般工业生产涉及阿拉伯糖和来苏糖的催化加氢还原法，整个过程需要昂贵的催化剂，生产过程能耗大，产物副产物多难以分离纯化。为了克服上述挑战，研究者选择引入生物合成方法以更经济环保地生产D
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阿拉伯糖醇。最初的研究结果表明，一些耐高渗酵母，如汉逊酵母属(Hansenula)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、鲁氏酵母属(Zygosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)可以通过发酵生产D
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阿拉伯糖醇。
[0003]巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)被广泛用作异源蛋白质和有价值的化学品生产的有效宿主。P.pastoris表达系统具有诸多优点：(1)拥有多种类型的表达宿主和载体，基因操作相对简单；(2)外源基因通过同源重组单交换或双交换的方式整合入基因组，能有效地避免外源基因丢失；(3)培养条件相对简单，容易培养至高细胞密度；(4)能进行复杂的蛋白翻译后修饰，利于外源基因的折叠和分泌。尽管如此，P.pastoris表达系统也存在着一些缺点，比如生长及发酵周期相对较长，生产率较低；以AOX1启动子调控表达基因时需要使用甲醇作为诱导物，而甲醇易燃易爆，在发酵过程中大量使用甲醇存在较大的安全隐患，且甲醇的毒性使得以甲醇诱导生产的蛋白难以应用于食品或药品等工业领域，等等。本专利技术将采用组成表达系统，避免了甲醇这种有毒的有机物质作为碳源添加到培养基中，极大地提升了毕赤酵母产物的安全性。其次，利用组成型表达系统进行外源蛋白的表达，避免了在生产过程中更换碳源的步骤，这不仅提高了操作的便捷性，也提高了生产过程中的安全性。
[0004]因此，如何利用毕赤酵母，通过生物方法高效生产D
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阿拉伯糖醇，仍是本领域亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在不足，本专利技术提供了一种毕赤酵母工程菌及其构建方法与应用。在本专利技术中，利用基因工程手段，在P.pastoris GS115的基础上构建了协同表达6
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磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)和6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶(G6PDH)的毕赤酵母工程菌，记为P.pastoris GS115/zwf1
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gnd2，并在此基础上进一步构建了D
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阿拉伯糖醇脱氢酶(ArDH)基因不同拷贝数的重组毕赤酵母工程菌；所述重组毕赤酵母工程菌能够用于高效生产D
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阿拉伯糖醇。
[0006]本专利技术中首先提供了一种重组毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌命名为P.pastoris GS115/zwf1
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gnd2
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ardh，其通过在P.pastoris GS115上构建表达6
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磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)基因、6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶(G6PDH)基因和不同拷贝数的D
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阿拉伯糖醇脱氢酶(ArDH)基因而得到。
[0007]其中，所述G6PD的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0008]所述G6PDH的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
[0009]所述ArDH的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示，氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。
[0010]其中，D
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阿拉伯糖醇脱氢酶(ArDH)基因的拷贝数为1～6。
[0011]本专利技术中还提供了上述赤酵母工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：
[0012](1)表达6
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磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)基因的重组载体构建：
[0013]PCR扩增6
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磷酸葡萄糖脱氢酶基因(zwf1)并使用无缝克隆技术克隆至表达载体中，获得6
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磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)基因表达载体。
[0014]其中，所述6
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磷酸葡萄糖脱氢酶基因(zwf1)来源于巴斯德毕赤酵母(Pachia pastoris)；所述表达载体包括但不限于pGAPZB、pTEF1、pGCW14。
[0015](2)表达6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶(G6PDH)基因的重组载体构建：
[0016]PCR扩增6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gnd2)并使用无缝克隆技术克隆至表达载体中，获得6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶(G6PDH)基因表达载体。
[0017]其中，所述6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gnd2)来源于巴斯德毕赤酵母(Pachia pastoris)；所述表达载体包括但不限于pGAPZB、pTEF1、pGCW14。
[0018](3)协同表达G6PD和G6PDH的毕赤酵母工程菌构建：
[0019]PCR扩增G6PDH表达载体上的启动子
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gnd2基因
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终止子片段P
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gnd2
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T，使用无缝克隆技术分别克隆至G6PD表达载体中，表达载体线性化后电转至巴斯德毕赤酵母P.pastoris GS115、经筛选阳性克隆以及测序成功获得协同表达G6PD和G6PDH的毕赤酵母工程菌，记为P.pastoris GS115/P1
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zwf1
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P2
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gnd2，其中P1、P2表示不同启动子。
[0020](4)D
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阿拉伯糖醇脱氢酶(ArDH)基因不同拷贝数的工程菌构建：
[0021]PCR扩增来源于假丝酵母的D
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阿拉伯糖醇脱氢酶基因ardh，使用无缝克隆技术克隆至表达载体中，获得含有不同拷贝ardh的表达载体，转化至协同表达G6PD和G6PDH的毕赤酵母工程菌中、经筛选阳性克隆以及测序成功获得D
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阿拉伯糖醇脱氢酶基因不同拷贝数的重组毕赤酵母工程菌，记为P.pastoris GS115/zwf1
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gnd2
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nardh(n＝拷贝数)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述重组毕赤酵母工程菌命名为P.pastoris GS115/zwf1
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gnd2
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nardh，，n为拷贝数；所述重组毕赤酵母工程菌通过在P.pastoris GS115上构建表达6
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磷酸葡萄糖脱氢酶、6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶和不同拷贝数的D
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阿拉伯糖醇脱氢酶基因而获得。2.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述G6PD的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；所述G6PDH的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；所述ArDH的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示，氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。3.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述D
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阿拉伯糖醇脱氢酶基因的拷贝数为1～6。4.权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括：(1)表达6
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磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)基因的重组载体构建：PCR扩增6
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磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf1并使用无缝克隆技术克隆至表达载体中，获得6
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磷酸葡萄糖脱氢酶基因表达载体；(2)表达6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶(G6PDH)基因的重组载体构建：PCR扩增6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因gnd2并使用无缝克隆技术克隆至表达载体中，获得6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因表达载体；(3)协同表达G6PD和G6PDH的基因工程菌的构建：PCR扩增G6PDH表达载体上的启动子
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gnd2基因
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终止子片段P
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gnd2
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T，使...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐向辉，窦媛，张宇飞，翟彼得，尤瓦，赵梅，孙雷，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：