一种高产木栓酮的重组酵母工程菌制造技术

本发明专利技术涉及一种高产木栓酮的重组酵母工程菌，所述重组菌过表达tHMG1、ERG1、ERG9和ERG20；或tHMG1、ERG1、ERG9和POS5；并且，敲除了BTS1、ROX1、YPL064w和YJL062w基因，导入雷公藤木栓酮编码基因后，可以高效表达木栓酮。可以高效表达木栓酮。可以高效表达木栓酮。

【技术实现步骤摘要】
一种高产木栓酮的重组酵母工程菌


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种用于生产木栓酮的重组酵母工程菌。

技术介绍

[0002]木栓酮(friedelin)是一类木栓烷型五环三萜成分，存在于多种植物的栓皮或茎的外皮部。近些年药理学研究表明，木栓酮具有抗氧化、抗炎、降血脂等活性，能够抑制白血病细胞的生长和转移(Chang
[2]et al.,2020)，在大鼠身上表现出抗糖尿病作用(Sunil
[8]et al.,2021)，抑制乳腺癌MCF
‑
7细胞生长(Subash
‑
Babu
[7]P,2017)。另外，木栓酮在植物保护中发挥着出良好的抗虫效果(Baskar
[1]et al.,2014)。
[0003]以木栓酮为骨架的一系列三萜类衍生物进一步得以分离鉴定，在药理活性挖掘中具有非常大的潜力，尤其以雷公藤中分离得到的活性物质雷公藤红素(celastrol)具有显著的减肥效果，成为极具潜力的减肥新药，使其备受关注。具有抗类风湿性关节炎、较为普遍的抗肿瘤活性、抗氧化、神经元保护、降血糖等药理活性，更是在2007年被国际顶级期刊《Cell》杂志列为最有可能发展为药物的5种天然产物之一。然而，木栓烷类成分在植物中的含量非常低，从植物皮部的直接提取将对植物造成致命的损伤，化学合成的方法获得因低效率、高消耗及污染环境等突出问题面临巨大挑战。酵母中共享与植物三萜上游共同途径，即2,3
‑
氧化角鲨烯的生物合成途径，能够提供2,3
‑
氧化角鲨烯这一三萜合成的前体物质。同时，酵母表达膜蛋白的兼容性和基因改造的可行性使得酵母成为了三萜合成的最优底盘。运用合成生物学和代谢工程的方法，通过在微生物系统中异源重建生物合成途径实现这些高价值天然产物是目前最为高效且环保的策略，构建能够高产木栓酮重组菌及生产过程具有重要应用价值。
[0004]酵母可以内源合成2,3
‑
氧化角鲨烯，为多数三萜生物合成提供共有的前体，继而在角鲨烯环化酶环化成不同三萜骨架，最后在细胞色素P450氧化酶、糖基转移酶和甲基转移酶等后修饰作用下形成种类繁多的三萜中间体及皂苷终产物。其中木栓酮合酶(friedelin synthase,FRS)催化2,3
‑
氧化角鲨烯生成木栓酮，这一环化机制是目前植物中最高度重排的反应，FRS基因在不同植物中存在。Hansen
[3]等人在酵母菌株AM238(rox1,dos2,yer134c,vba5,ynr063w,ygr259c)中敲除了UBC7基因改造后得到菌株AM254，以质粒形式导入大叶落地生根的PdFRS基因能够产生0.5mg
·
L
‑1。Zhou
[9]等人在酵母BY4741中以质粒形式过表达了ERG9和tHMG1基因，同时敲除rox1，ypl062w和yjl064w得到重组菌株ZH1，引入雷公藤中TwOSC1T
502E
基因进行培养基优化后，能够生成37.07mg
·
L
‑1木栓酮。目前已报到的微生物合成的木栓酮产量都较低，且多个质粒形式容易导致丢失。一般认为多个转录单元的引入会延长酵母菌的生长周期，本专利技术通过在染色体水平整合多个转录单元以及敲除旁路抑制基因后，优势菌株GH3、GD3和GQ3生产的木栓酮的量逐步提高，但是并未出现生长周期延长的现象。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一方面是提供一种高产木栓酮的酵母工程菌。
[0006]所述重组酵母菌包括木栓酮合酶编码基因，并且在所述重组酵母菌中过表达：
[0007](1)tHMG1、ERG1和ERG9基因；以及
[0008](2)选自ERG20、POS5或UPC2.1基因中的任意一种或多种；
[0009]所述木栓酮合酶选自来源于刺叶美登木的木栓酮合酶、山杨的木栓酮合酶或雷公藤的木栓酮合酶。
[0010]一个优选的实施方案中，本专利技术所述的高产木栓酮的重组酵母工程菌，含有木栓酮合酶编码基因，并且在所述重组酵母菌中过表达：
[0011](1)tHMG1、ERG1和ERG9；以及
[0012](2)选自ERG20、或POS5、或ERG20和UPC2.1、或POS5和UPC2.1中的任意一组；
[0013]所述木栓酮合酶选自来源于刺叶美登木的木栓酮合酶、山杨的木栓酮合酶或雷公藤的木栓酮合酶。
[0014]一个更优选的实施方案是，本专利技术所述的高产木栓酮的重组酵母工程菌，含有木栓酮编码基因，并且在所述重组酵母菌中过表达：
[0015]tHMG1、ERG1、ERG9和ERG20；或tHMG1、ERG1、ERG9和POS5；
[0016]本专利技术中，所述来源于刺叶美登木的木栓酮合酶或来源于山杨的木栓酮合酶，为本领域所公开的酶，氨基酸序列可通过GeneBank数据库中查询得到，如来源于美登木的木栓酮合酶的氨基酸序列如GeneBank：APG38073.1，其编码基因GenBank:KX147270.1；来源于山杨的木栓酮合酶氨基酸序列如GeneBank：ART66198.1，其编码基因如GeneBank：KY931453.1。
[0017]一个优选的实施方案是，所述木栓酮合酶为选自雷公藤的木栓酮合酶(简写为TwOSC1
T502E
)，所述TwOSC1
T502E
的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，将编码SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的核苷酸(或称为雷公藤木栓酮合酶编码基因，简写为TwOSC1
T502E
)。一个具体的实施方案是，所述雷公藤木栓酮合酶编码基因TwOSC1
T502E
具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。
[0018]本专利技术的一个具体实施方案中，对4种初始重组菌，即GH1(过表达tHMG1、ERG20、ERG1、ERG9和UPC2.1)、GH2(过表达tHMG1、POS5、ERG1、ERG9和UPC2.1)、GH3(过表达tHMG1、ERG20、ERG1和ERG9)、GH4(过表达tHMG1、POS5、ERG1和ERG9)分别导入不同来源的木栓酮合酶编码基因，发现，导入来源于雷公藤(Tripterygium wilfordii.Hook.f.)的木栓酮合酶(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)编码基因TwOSC1
T502E
(基因序列如SEQ ID NO：1所示)，木栓酮的产量明显要高于来源于刺叶美登木(Maytenusilicifolia)的木栓酮合酶编码基因MiFRS(基因序列见GenBank:KX147270.1)和来源于山杨(Populus davidiana)的木栓酮合酶编码基因PdFRS(基因序列见Genbank:KY931453.1)。因此，本专利技术的一个优选的实施方案是，本专利技术所述的高产木栓酮的重组酵母工程菌，木栓酮合酶编码基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产木栓酮的重组酵母菌，包含木栓酮合酶编码基因，所述重组酵母菌：(1)过表达tHMG1、ERG1和ERG9；以及(2)过表达选自ERG20、POS5或UPC2.1中的任意一种或多种；所述木栓酮合酶选自来源于刺叶美登木的木栓酮合酶、山杨的木栓酮合酶或雷公藤的木栓酮合酶。2.根据权利要求1所述的高产木栓酮的重组酵母菌，包含木栓酮合酶编码基因，其中所述重组酵母菌：(1)过表达tHMG1、ERG1和ERG9；以及(2)过表达选自ERG20、或POS5、或ERG20和UPC2.1、或POS5和UPC2.15中的任意一组；所述木栓酮合酶选自来源于刺叶美登木的木栓酮合酶、山杨的木栓酮合酶或雷公藤的木栓酮合酶。3.根据权利要求2所述的高产木栓酮的重组酵母菌，包含木栓酮合酶编码基因，其中所述所述重组酵母菌：过表达tHMG1、ERG1、ERG9和ERG20；或过表达tHMG1、ERG1、ERG9和POS5；所述木栓酮合酶为来源于雷公藤的木栓酮合酶。4.根据权利要求3所述的高产木栓酮的重组酵母菌，其中所来源于雷公藤的木栓酮合酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。5.根据权利要求4所述的高产木栓酮的重组酵母菌，其中所述雷公藤的木栓酮合酶的编码基因具有SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：高伟，高海云，赵欢，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：