一种亚细胞区室化生产衣康酸的解脂耶氏酵母工程菌及应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种区室化生产衣康酸的解脂耶氏酵母工程菌构建及应用。所述基因工程菌以解脂耶氏酵母为出发菌株，将顺

【技术实现步骤摘要】
一种亚细胞区室化生产衣康酸的解脂耶氏酵母工程菌及应用

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[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种区室化生产衣康酸的解脂耶氏酵母工程菌构建及应用。

技术介绍
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[0002]解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种非常规的产油酵母，由于其充足的前体供应，适于生产各种源于乙酰辅酶A的下游化合物。但以葡萄糖为碳源时，产生乙酰辅酶A的同时会伴随二氧化碳(CO2)的释放，造成碳损失及得率的降低。而以脂肪酸作为底物时，脂肪酸转化成酰基辅酶A后进入过氧化物酶体，经过β
‑
氧化产生乙酰辅酶A，这一过程不产生CO2，不存在碳源的损失，具有更高的碳转化率。近年来越来越多的研究表明，特定酶或者代谢途径的亚细胞定位不仅有助于提高产物转化效率，而且能够起到消除竞争性代谢抑制的作用。
[0003]区室化工程是利用细胞中细胞器独特的生理生化功能进行代谢工程与合成生物学研究等。同时，由于细胞器膜的阻隔，代谢途径的细胞器或者亚细胞定位能够避免胞质环境的代谢竞争，提高产物合成效率。细胞器有许多独特的生理和代谢环境，比如内质网与脂质的形成有关，过氧化物酶体参与脂肪酸的β
‑
氧化且具有较高的蛋白质浓度，细胞核富含DNA等等。
[0004]衣康酸(C5H6O4)学名为甲叉琥珀酸，亚甲基丁二酸，是一种不饱和二元有机酸。它含有不饱和双键，具有活泼的化学性质，可进行自身间的聚合，也能与其他单体如丙烯腈等聚合，微溶于苯、氯仿、乙醚、石油醚、二硫化碳，溶于水、乙醇、丙酮；能进行各种加成反应，酯化反应和聚合反应，是化学合成工业的重要原料，也是化工生产的重要原料。其在酸性、中性和中等碱性条件下均表现为性质稳定，可用于树脂、纤维、洗涤剂、清洁剂和生物活性成分等工业产品的合成。衣康酸的工业生产有化学合成和生物合成两种方式，化学合成主要是利用化工方法从石油化工产品中制备，然而这种方法存在原料利用率低、产品不易分离纯化的问题，使其在大规模工业化生产中受到了限制。衣康酸的生物合成方法是指通过对微生物代谢途径的遗传修饰来完成目标产物的制备。其中，土曲霉、玉米黑粉菌、念珠菌属、毕赤酵母等真菌天然生产衣康酸的能力较强。然而，真菌具有菌丝表型，这是因为它们对剪切应力的耐受性较差。高度分支的菌丝丝在发酵过程中产生高的肉汤粘度，这给常规搅拌槽发酵罐中的混合和通气过程带来了重大挑战。此外，它们发酵需要添加碱以维持中性pH条件，这也增加了培养期间细菌污染的可能性。解脂耶氏酵母本身并不能产生衣康酸，但它对衣康酸具有较高的耐受性。因此近年来，利用代谢工程及合成生物学改造解脂耶氏酵母异源生产衣康酸成为了相关研究的热点。

技术实现思路
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[0005]本专利技术所要解决的技术问题就是解决在解脂耶氏酵母中异源合成衣康酸产量低的问题，提供一株导入顺
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乌头酸脱羧酶(CAD)基因的解脂耶氏酵母基因工程菌以及该菌株
在异源合成衣康酸中的用途，其能够合成衣康酸并通过代谢工程或合成生物学手段提高衣康酸产量。
[0006]本专利技术提供的技术方案之一：是一种解脂耶氏酵母基因工程菌，所述基因工程菌以解脂耶氏酵母为出发菌株，通过导入顺
‑
乌头酸脱羧酶编码基因来获得。
[0007]所述顺
‑
乌头酸脱羧酶编码基因，其核苷酸如序列表SEQ ID NO.1所示；是通过土曲霉HAT418的基因组上两段不含内含子的基因片段进行融合获得的。
[0008]进一步地，所述CAD基因是通过质粒在宿主细胞中表达；
[0009]更进一步地，所述质粒为pYLEX1；
[0010]进一步地，所述CAD基因通过增强型过氧化物酶体定位信号(ePTS1)在过氧化物酶体中进行定位表达；
[0011]更进一步地，将ePTS1编码序列连接到CAD基因序列的后面，构建重组质粒pYLEX1
‑
CAD
‑
ePTS1，并将重组质粒导入解脂耶氏酵母出发菌株中进行表达；
[0012]更进一步地，所述ePTS1编码序列如序列表SEQ ID NO.2所示(ctgggccgaggacgacgatccaagctg)；
[0013]优选地，所述解脂耶氏酵母出发菌株为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1gΔku70。
[0014]本专利技术提供的技术方案之二，是上述解脂耶氏酵母基因工程菌的应用，特别是在生产衣康酸中的应用；
[0015]进一步地，采用上述解脂耶氏酵母基因工程菌发酵生产衣康酸的方法如下：
[0016]将工程菌种子液按1％接种量接种至YPD培养基中，28
‑
30℃，200
‑
220r/min条件培养15
‑
18h，再转接至YPO培养基中使OD
600
达到0.1左右，28
‑
30℃，200
‑
220r/min条件下发酵6天。
[0017]所述YPD培养基组成成分为：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，余量为水，115
‑
121℃，灭菌20min。
[0018]所述YPO培养基组成成分为：蛋白胨18
‑
22g/L，酵母浸粉8
‑
12g/L，厨房废油1.1
‑
1.2％，吐温80 0.18
‑
0.22％，余量为水，115
‑
121℃，灭菌20min。
[0019]有益效果：
[0020]本专利技术通过在解脂耶氏酵母中异源引入CAD基因证实了生产衣康酸的可能(宿主解脂耶氏酵母Po1gΔku70本身不能生产衣康酸)，产量为33.12mg/L。本专利技术还利用绿色荧光蛋白和尼罗红亲脂性的特性验证了增强型过氧化物酶体定位信号ePTS1在解脂耶氏酵母中是起到作用的。同时本专利技术第一次将CAD基因在解脂耶氏酵母的过氧化物酶体中进行异源定位表达，通过消耗厨房废油的脂肪酸来生产衣康酸。
[0021]结果表明，通过引入ePTS1将衣康酸在过氧化物酶体中进行区室化表达后，与单纯异源表达CAD基因的菌株相比衣康酸产量有明显提升，产量为1.58g/L，提高了47倍左右；采用厨房废油(YPO)为培养基，相对于普通YPD培养基，衣康酸产量提高了108倍左右。可见，定位改造后的基因工程菌株，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率；而采用厨房废油作为培养基不仅实现废物利用，降低成本，而且产量远远高于常用普通培养基。
附图说明：
[0022]图1衣康酸生产途径示意图；
[0023]图2为CAD基因重组质粒的构建图；
[0024]图3为验证基因片段凝胶电泳图
[0025]其中，图a为重组质粒pYLEX1
‑
CAD验证图；图b为重组菌株Po1gΔku70
‑
CAD
‑
ePTS1验证图；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以解脂耶氏酵母为出发菌株，通过导入顺
‑
乌头酸脱羧酶编码基因获得。2.如权利要求1所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述顺
‑
乌头酸脱羧酶编码基因，其核苷酸如序列表SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求2所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述顺
‑
乌头酸脱羧酶编码基因是通过质粒在宿主细胞中表达。4.如权利要求3所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述质粒为pYLEX1。5.如权利要求1所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述顺
‑
乌头酸脱羧酶编码基因通过增强型过氧化物酶体定位信号ePTS1在过氧化物酶体中进行定位表达。6.如权利要求5所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，将ePTS1编码基因连接到顺
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乌头酸脱羧酶编码基因后，构建重组质粒pYLEX1
‑
CAD
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ePTS1，并将重组质粒导入解脂耶氏酵母出发菌株中进行表达。7.如权利要求5所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述eP...

【专利技术属性】
技术研发人员：于爱群，荣兰新，卢志慧，王亚平，肖冬光，张翠英，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：