用于亚精胺产生的微生物细胞制造技术

本发明专利技术总体上涉及能够产生高水平亚精胺和/或亚精胺衍生物的修饰的微生物细胞。所述经基因修饰的微生物细胞包含至少一种对经腐胺的天然亚精胺生物合成途径的修饰以及参与S‑腺苷甲硫氨酸生物合成途径的基因。

Microbial cells for spermidine production

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于亚精胺产生的微生物细胞
本专利技术总体上涉及基因工程改造微生物的开发。更具体地讲，本专利技术涉及能够以经济方式产生长寿化合物亚精胺的微生物细胞。背景亚精胺为一种低分子量的脂肪族氮化合物，广泛存在于微生物、植物和动物中。在细胞内，其衍生于L-鸟氨酸，后者为L-精氨酸生物合成的中间体。近年来已经显示，该化合物可促进从微生物到哺乳动物范围内各种生物体的寿命。另外，还显示出亚精胺的摄取可减轻或保护免于各种与年龄相关的病症，包括癌症、多发性硬化、骨质疏松症、心血管疾病、记忆缺陷、皮肤衰老和脱发。因此，越来越有兴趣获得这种化合物的经济、可靠和可持续的供给。一些专利技术描述了亚精胺的化学合成。然而，这些方法要么存在底物昂贵、对映体纯的纯度差的问题，要么对环境不友好。亚精胺也可源于生物来源，比如小麦胚芽。然而，即使产生最高亚精胺的天然来源也仅能产生约200μg/g水平的亚精胺，使得获得纯产物非常昂贵。从微生物来源产生亚精胺可克服这些问题。然而，微生物来源天然产生仅低水平的亚精胺，因此需要另外的工程改造来获得经济上可行的产生水平。迄今为止，仅有很少的研究描述了微生物细胞工程改造以过量产生亚精胺。Qin等[1]描述了酵母细胞中鸟氨酸代谢的工程改造与过表达亚精胺产生基因以过量产生亚精胺的组合，导致产生35mg/L的亚精胺。Kim等[2]和Kim等[3]报道了用于增强细胞内亚精胺产生的工程改造酵母细胞。在这些细胞中，编码鸟氨酸脱羧酶(ODC)抗酶(一种参与亚精胺生物合成途径反馈抑制的蛋白)的OAZ1和编码多胺转运蛋白的TPO1被破坏，从而分别通过减轻对ODC的反馈抑制和防止亚精胺排泄来增加细胞内亚精胺水平。与亚精胺合成基因相结合，这导致细胞亚精胺含量的增加，每克干细胞重量(DCW)的含量为1.1mg亚精胺。Kim等[4]报道了酵母中亚精胺合成基因的过表达结合OAZ1的破坏、转运蛋白TPO1的表达和发酵优化，分批产生63.6mg/L的亚精胺，并且以分批补料(2.2mg/g糖)最高可达224mg/L。然而，在以微生物细胞产生亚精胺的领域仍有改进空间。概述本专利技术的主要目的为提供一种用于亚精胺产生的改进的微生物细胞。这种细胞可用于基于发酵产生亚精胺。本文公开的微生物细胞和方法将亚精胺途径基因的过表达与涉及参与亚精胺产生的辅因子或共底物(特别是S-腺苷甲硫氨酸(SAM))的合成和再生的途径修饰相结合。SAM随后可转化为脱羧S-腺苷甲硫氨酸(dSAM)，并用于亚精胺合成。实施方案的一个方面涉及能够产生亚精胺的微生物细胞。将微生物细胞进行基因修饰以用于过表达S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶和/或亚精胺合酶。还将微生物细胞进行基因修饰以用于增强SAM的生物合成。实施方案的另一方面涉及一种用于产生亚精胺的方法。所述方法包括在适合于从根据实施方案的微生物细胞产生亚精胺的培养基中和培养条件下培养所述微生物细胞。所述方法还包括从培养基和/或微生物细胞中收集亚精胺。实施方案的另一方面涉及根据实施方案的微生物细胞作为食品添加剂的用途。先前增加微生物细胞中亚精胺产生的努力将使腐胺转化为亚精胺的基因的过表达与SAM脱羧酶的过表达相结合。尽管显示了dSAM水平的增加有益于亚精胺的产生，但是没有研究报道SAM本身为亚精胺产生的限制因素。我们令人惊讶地发现SAM本身确实限制亚精胺产生。这令人惊讶，因为与主要参与亚精胺和精胺产生的dSAM不同，SAM为细胞中常见的共底物。通过增加该共底物的前体库和/或增加SAM的回收利用，我们可显著增加亚精胺产生。通过将该策略与先前报道的策略相结合，我们能够产生出>1g/L和>30mg/gDCW的亚精胺纪录，代表相对于先前工艺的显著改进。附图简述通过参考以下结合附图的描述，可最好地理解实施方案及其进一步的目的和优点，其中：图1：导致真核微生物细胞(比如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))中从葡萄糖产生亚精胺的天然途径的概述。尽管没有区分，在原核微生物中也发生类似反应。显示了可靶向经鸟氨酸途径增加亚精胺产生的重要反应的EC编号。EC编号旁边的向上灰色箭头表示经基因修饰增加的反应，而向下箭头表示减少的反应。图2：本专利技术中靶向的经SAM途径增加亚精胺产生的反应概述。显示了重要反应的EC编号。EC编号旁边的向上灰色箭头表示经基因修饰增加的反应，而向下箭头表示减少的反应。缩写：SAM：S-腺苷甲硫氨酸，dSAM：脱羧S-腺苷甲硫氨酸，MTA：5’-甲硫腺苷，MRP：S-甲基-5-硫代-D-核糖1-磷酸，MOB：4-甲基硫代-2-氧代丁酸，THF：亚甲基四氢叶酸，H2S：硫化氢。图3：通过异源途径基因的过表达在微生物细胞中产生亚精胺。在该实例中，亚精胺由腐胺和L-天冬氨酸-4-半醛的缩合产生。异源酶羧基(降)亚精胺脱氢酶(CASDH/CANSDH)[EC1.5.1.43]和羧基(降)亚精胺脱羧酶(CASDC/CANSDC)[EC4.1.1.96]在酵母细胞中过表达。酶取自空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)(质粒YP1)或霍乱弧菌(Vibriocholera)(质粒YP2)。这些酶在酵母中的过表达导致亚精胺的产生增加。图4：通过结合亚精胺合成基因的过表达和导致L-天冬氨酸-4-半醛形成的途径上调，在微生物细胞中产生亚精胺。通过过表达异源性天冬氨酸激酶(Cglycm)、天冬氨酸-半醛脱氢酶(Cgasd)和天冬氨酸氨基转移酶(CgaspB)来实现增加向L-天冬氨酸4-半醛的通量。另外，通过在编码高丝氨酸脱氢酶(HOM6)的内源性基因前面插入弱Kex2p启动子来减少向竞争性高丝氨酸脱氢酶反应的通量。所有修饰均在酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)中进行。该图表明，与单独的亚精胺生物合成基因过表达相比较，增加向L-天冬氨酸-4-半醛的通量和减少向竞争性反应的通量导致亚精胺产生增加。图5：通过结合亚精胺合成基因(包括S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(EC4.1.1.50)和亚精胺合酶(EC2.5.1.16))的过表达以及腐胺生物合成途径(“SPD增加”)和甲硫氨酸补救途径的上调，在微生物细胞中产生亚精胺。在酿酒酵母中通过内源性MEU1基因的过表达提高甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)[EC2.4.2.28]的活性，或通过内源性BAT2基因的过表达提高支链氨基酸转氨酶(BAT)[EC2.6.1.42]的活性，允许增加通过甲硫氨酸补救途径的通量，并增加亚精胺产生。图6：经分批补料发酵在微生物细胞中产生亚精胺。最佳产生菌株(SPDC10)在葡萄糖限制性分批补料条件下生长，导致产生高达1.4g/L的亚精胺。图7：实施例1-4中用于质粒表达的构建体的图谱。图8：通过结合亚精胺合成基因(包括S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(EC4.1.1.50)和亚精胺合酶(EC2.5.1.16))的过表达以及腐胺生物合成途径(“SPD增加”)和甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)[EC2.5.1.6]的过表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够产生亚精胺的微生物细胞，其中/n所述微生物细胞经基因修饰以过表达至少一种选自S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(EC4.1.1.50)和亚精胺合酶(EC 2.5.1.16)的酶；和/n所述微生物细胞经基因修饰以增强S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的生物合成。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170714 SE 1750933-21.一种能够产生亚精胺的微生物细胞，其中
所述微生物细胞经基因修饰以过表达至少一种选自S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(EC4.1.1.50)和亚精胺合酶(EC2.5.1.16)的酶；和
所述微生物细胞经基因修饰以增强S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的生物合成。


2.权利要求1的微生物细胞，其中所述微生物细胞经基因修饰以过表达至少一种选自以下的酶：鸟氨酸脱羧酶(ODC)(EC4.1.1.17)、N-乙酰谷氨酸合酶(NAGS)(EC2.3.1.1)、乙酰谷氨酸激酶(EC2.7.2.8)、N-乙酰基-γ-谷氨酰磷酸还原酶(EC1.2.1.38)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.11)、乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(EC3.5.1.16)和鸟氨酸乙酰转移酶(EC2.3.1.35)。


3.权利要求1-2中任何一项的微生物，其中所述微生物细胞经基因修饰以减弱鸟氨酸脱羧酶抗酶(OAZ)、L-鸟氨酸转氨酶(EC2.6.1.13)和/或鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)(EC2.1.3.3)的活性，或者缺失或破坏至少一种选自编码OAZ的基因、编码L-鸟氨酸转氨酶的基因和编码OTC的基因的基因。


4.权利要求1-3中任何一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞经基因修饰以通过过表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MAT)(EC2.5.1.6)而增强S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的生物合成。


5.权利要求1-4中任何一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞经基因修饰以通过过表达亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)(EC1.5.1.20)而增强S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的生物合成。


6.权利要求1-5中任何一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞经基因修饰以通过过表达磷酸核糖二磷酸(PRPP)5-酰胺转移酶(EC2.4.2.14)而增强S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的生物合成。


7.权利要求1-6中任何一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞经基因修饰以在甲硫氨酸补救途径中过表达至少一种选自以下的酶而增强S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的生物合成：甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)(EC2.4.2.28)、5-甲硫核糖-1-磷酸异构酶(MRI)(EC5.3.1.23)、甲硫核酮糖-1-磷酸脱水酶(MDE)(EC4.2.1.109)、2,3-二氧代甲硫戊烷-1-磷酸烯醇酶/磷酸酶(EC3.1.3.77)、酸式还原酮双加氧酶(EC1.13.11.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：J秦，A克日沃卢奇科，F大卫，J尼尔松，
申请(专利权)人：克里希有限公司，
类型：发明
国别省市：爱尔兰;IE