生产多胺类似物的酵母制造技术

本发明专利技术涉及在能够生产至少一种多胺的酵母细胞中的多胺类似物的生产。该酵母细胞还包含4

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产多胺类似物的酵母


[0001]本专利技术总体涉及遗传工程化酵母，并且特别涉及能够生产多胺类似物的这类酵母。

技术介绍

[0002]在自然界中广泛分布的多胺类似物正应用于解决卫生部门和农业部门中的挑战。例如，包含酰胺键的多胺类似物(诸如N1‑
香豆酰基
‑
精胺、N1‑
脒基
‑
1,7
‑
二胺基
‑
庚烷和N1,N
11
‑
二乙基
‑
降精胺)代表一类重要的抗病毒剂、抗氧化剂、拮抗剂、和化疗剂，其在对抗人类疾病(诸如癌症)和新兴的病毒威胁(例如，COVID
‑
19)中具有潜在的应用。同样，广泛分布并且包含酰胺键的羟基肉桂酸酰胺的二胺和多胺(诸如二对香豆酰基
‑
咖啡酰基
‑
亚精胺)可以显著地减少白粉病真菌(禾布氏白粉菌(Blumeria graminis))感染，证明其在抗击真菌病原体中潜在的应用。
[0003]然而，由于其结构复杂性和在自然界中的低丰度，从传统的合成化学或自天然来源的提取均难以获得多胺类似物。已经寻求在快速生长、遗传上易处理的物种中基于微生物的生产作为天然产物及它们的衍生物的传统供应链的替代方案。特别地，面包师的酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)已经用做细胞工厂用于生产许多不同的燃料、化学品、食品配料和医药品，特别是为了它的天然产物生产。事实上，Microbial Cell Factories (2016) 15: 198公开了将不同的BAHD酰基转移酶编码序列克隆到包含拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因At4CL5的载体中，以用于在酵母酿酒酵母中共表达BAHD酰基转移酶和At4CL5，以及各种羟基肉桂酸缀合物和苯甲酸缀合物的生产。
[0004]遗憾的是，解开多胺类似物的化学空间以用于进一步的药理学和杀虫研究受到几个限制的阻碍。(i)从传统的合成化学或自天然来源的提取均难以获取多样的多胺(即，用于合成或生物合成多胺类似物的前体)，由此限制了多胺类似物的多样性；(ii)缺少关于多胺和多胺类似物生物合成的知识，例如，生物合成酶；以及(iii)缺少关于多胺的生化功能的知识，由此限制了它们的临床使用。
[0005]因此，期望开发用于天然多胺及它们的类似物的生产的新方法，以及开发用于获得这些结构的天然变体和非天然变体两者的新技术和价值链。

技术实现思路

[0006]提供能够生产多胺类似物的酵母细胞是总体的目的。
[0007]通过实施方案满足该目的以及其他目的。
[0008]在独立权利要求中定义了本专利技术。在从属权利要求中定义了本专利技术进一步的实施方案。
[0009]本专利技术涉及能够生产至少一种多胺类似物的酵母细胞。该酵母细胞能够生产至少一种多胺。该酵母细胞还包含4
‑
香豆酸: CoA连接酶编码基因、至少一种多胺N
‑
酰基转移酶基因以及至少一种多胺合酶编码基因，但是缺少多胺氧化酶编码基因或包含扰乱的多胺氧
化酶编码基因。
[0010]本专利技术还涉及生产多胺类似物的方法。该方法包含在培养基中并且在适合于通过根据本专利技术的酵母细胞生产多胺类似物的培养条件下培养所述酵母细胞。该方法还包含从培养基和/或从酵母细胞中收集多胺类似物。
[0011]本专利技术提供用于各种多胺类似物的生产的有效手段，所述多胺类似物包括单取代和/或多取代N
‑
酰基化多胺。因此本专利技术可以用作涉及传统的合成化学或自天然来源的提取以获得多胺类似物的现有技术方法的有成本效益的替代方案。
附图说明
[0012]通过参考以下与附图一起的描述可以最好地理解实施方案，连同其进一步的目的和优点，其中：图1a至1f说明用于亚精胺和高级多胺(higher
‑
polyamine)过量合成的工程酵母代谢。
[0013]图2a和2b说明酵母中苦柯胺(kukosamine)的生产。
[0014]图3a至3f说明酵母中复杂的酚酰胺的生物合成。
[0015]图4a至4c说明酵母中复杂的酚酰胺的从头生物合成。
[0016]图5a和5b说明用于酵母中复杂的酚酰胺的生物合成的工程化途径。
[0017]图6说明用过量生产对香豆酸的菌株(QL58)在喂养氟取代芳香族氨基酸(3
‑
氟
‑
L
‑
苯丙氨酸；3
‑
F
‑
L
‑
Phe)时，氟取代和氢化的羟基肉桂酸的体内生产。(6a)，氟取代肉桂酸(3F
‑
CA)。(6b)，氟取代对香豆酸(3
‑
F
‑
pHCA)。(6c)，氟取代和氢化的对香豆酸(3
‑
F
‑
DHpHCA)。细胞培养上清液为用于LC
‑
MS分析的对象。选择LC
‑
MS色谱图用于各个感兴趣的化合物的理论m/z值。
[0018]图7说明用酵母多胺平台的氟取代羟基肉桂酸
‑
腐胺缀合物的体内生产。(7a)，N1‑3‑
氟肉桂酰基腐胺。(7b)，N1‑3‑
氟香豆酰基腐胺。(7c)，N1‑3‑
氟氢化香豆酰基腐胺。(7d)，N1,N6‑
双(3
‑
氟香豆酰基)腐胺。细胞培养上清液为用于LC
‑
MS分析的对象。选择LC
‑
MS色谱图用于各个感兴趣的化合物的理论m/z值。
[0019]图8说明用酵母多胺平台的氟取代羟基肉桂酸
‑
亚精胺缀合物的体内生产。(8a)，N1或N
10
‑3‑
氟肉桂酰基亚精胺。(8b)，N1或N
10
‑3‑
氟香豆酰基亚精胺。(8c)，N1或N
10
‑3‑
氟氢化香豆酰基亚精胺。(8d)，N1,N
10
‑
双(3
‑
氟香豆酰基)亚精胺。(8e)，N1,N5,N
10
‑
三(3
‑
氟香豆酰基)亚精胺。细胞培养上清液为用于LC
‑
MS分析的对象。选择LC
‑
MS色谱图用于各个感兴趣的化合物的理论m/z值。
具体实施方式
[0020]为了使得能够有效获取多胺类似物的多样性，我们工程化了酵母代谢以过量生产一类复杂的多胺，例如亚精胺、高亚精胺(homo
‑
spermidine)、热精胺(thermospermine)和精胺。通过具有按需定制途径(tailoring pathway)的多样的多胺类似物的生物合成证明该酵母平台的多用性。具体地，我们系统地重构了酵母中心碳代谢和氮代谢、甲硫氨酸补救途径、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.能够生产至少一种多胺类似物的酵母细胞，其中所述酵母细胞能够生产至少一种多胺；所述酵母细胞包含4
‑
香豆酸: CoA连接酶编码基因；所述酵母细胞包含至少一种多胺N
‑
酰基转移酶基因；所述酵母细胞包含至少一种多胺合酶编码基因；并且所述酵母细胞缺少多胺氧化酶编码基因或包含扰乱的多胺氧化酶编码基因。2. 根据权利要求1所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞被工程化以用于所述4
‑
香豆酸: CoA连接酶的过量表达。3. 根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述4
‑
香豆酸: CoA连接酶编码基因选自拟南芥(Arabidopsis thaliana) At4CL1、At4CL2、At4CL3、At4CL4、At4CL5和核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与4
‑
香豆酸: CoA连接酶At4CL1、At4CL2、At4CL3、At4CL4或At4CL5的任一个具有至少80%的序列同一性的4
‑
香豆酸: CoA连接酶，优选拟南芥At4CL1。4.根据权利要求1
‑
3的任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞被工程化以用于所述至少一种多胺N
‑
酰基转移酶的过量表达。5.根据权利要求1
‑
4的任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞包含所述至少一种多胺N
‑
酰基转移酶基因，其选自亚精胺羟基肉桂酰基转移酶编码基因、亚精胺香豆酰基
‑
CoA酰基转移酶编码基因和腐胺羟基肉桂酰基转移酶编码基因。6. 根据权利要求5所述的酵母细胞，其中所述亚精胺羟基肉桂酰基转移酶编码基因选自拟南芥AtSHT、渐狭叶烟草(Nicotiana attenuata) NaDH29和核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与亚精胺羟基肉桂酰基转移酶AtSHT或亚精胺羟基肉桂酰基转移酶NaDH29具有至少80%的序列同一性的亚精胺羟基肉桂酰基转移酶。7.根据权利要求5或6所述的酵母细胞，其中所述亚精胺香豆酰基
‑
CoA酰基转移酶编码基因选自拟南芥AtSCT和核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与亚精胺香豆酰基
‑
CoA酰基转移酶AtSCT具有至少80%的序列同一性的亚精胺香豆酰基
‑
CoA酰基转移酶。8.根据权利要求5
‑
7的任一项所述的酵母细胞，其中所述腐胺羟基肉桂酰基转移酶编码基因选自渐狭叶烟草NaAT1和核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与腐胺羟基肉桂酰基转移酶NaAT1具有至少80%的序列同一性的腐胺羟基肉桂酰基转移酶。9.根据权利要求1
‑
8的任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞能够生产至少一种有机酸，其选自芳香族有机酸、脂肪酸、卤代芳香族有机酸、卤代脂肪酸及其组合。10.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦久福，J，
申请(专利权)人：克里希有限公司，
类型：发明
国别省市：