D-木糖酸脱水酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种D‑木糖酸脱水酶，所述D‑木糖酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1～4所示，本发明专利技术通过易错PCR对来自大肠杆菌的D‑木糖酸脱水酶YjhG进行定向进化，得到四种D‑木糖酸脱水酶YjhG基因序列，将其转化大肠杆菌，获得几组活力较高的突变株91号、96号、62号和286号，这几个菌株在12h内所消耗木糖酸分别为4.2g/L、4.8g/L、6.22g/L、5.43g/L，而出发菌株(亲株A)在同等条件下消耗的木糖酸为2.15g/L，分别提高了2.1倍、2.4倍、2.89倍、2.5倍。

D-xylanase and its application

【技术实现步骤摘要】
D-木糖酸脱水酶及其应用
本专利技术属于微生物基因工程领域，具体涉及一种D-木糖酸脱水酶及其应用。
技术介绍
D-木糖酸脱水酶，系统命名是D-木糖酸氢-裂解酶，能催化木糖酸脱水反应。目前木糖酸脱水酶有不同的菌株来源，比如嗜盐的古细菌富盐菌、新月丙杆菌和假单胞菌。不同来源的D-木糖酸脱水酶可以利用不同的底物，比如D-葡萄糖酸、D-木糖酸和D-木糖。虽然已知源自大肠杆菌的木糖酸脱水酶YjhG具有催化D-木糖酸脱水的酶学活性，但关于其性质的研究报道较少。目前，已经可以确定D-木糖酸脱水酶是许多代谢途径中的重要酶。在一些高附加值的化学品如乙二醇、三元醇和四元醇等生物合成途径中，其中来源于大肠杆菌的木糖酸脱水酶YjhG被用来催化D-木糖酸脱水反应。例如在利用D-木糖通过生物途径生产D-1,2,4-丁三醇的过程中，该合成途径包括：(1)在D-木糖脱氢酶的催化下将D-木糖转化为D-木糖酸；(2)D-木糖酸在D-木糖酸脱水酶的催化下生成D-3-脱氧甘油戊酮糖酸；(3)D-3-脱氧甘油戊酮糖酸在2-酮酸脱羧酶的催化下生成D-3,4-二羟基丁醛；(4)在脱氢酶催化下D-3,4-二羟基丁醛生成D-1,2,4-丁三醇。该酶对微生物发酵生产乙二醇、三元醇和四元醇的产量和质量有重要影响，但是，木糖酸脱水酶存在着反应速率缓慢，导致催化反应时间较长。因此，继续筛选一种具有高催化效率的木糖酸脱水酶，以提高木糖酸脱水酶的反应速率。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是通过定向进化的技术手段提供一种具有高催化效率的木糖酸脱水酶YjhG。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述木糖酸脱水酶YjhG在制备多元醇中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：D-木糖酸脱水酶，所述D-木糖酸脱水酶的氨基酸序列如SEQIDNO.：1～4所示。编码上述D-木糖酸脱水酶的基因序列在本专利技术的保护范围之内，将SEQIDNO.：1～4所示的核苷酸序列翻译为基因序列即可得到本专利技术中所述的编码D-木糖酸脱水酶的基因序列。一种重组质粒，该重组质粒中包含上述编码D-木糖酸脱水酶的基因序列。一种重组细胞，该重组细胞中包含上述编码D-木糖酸脱水酶的基因序列。上述D-木糖酸脱水酶在制备多元醇中的应用在本专利技术的保护范围之内。作为优选，所述的多元醇为1,2,4-丁三醇。一株产1,2,4-丁三醇的基因工程菌，在大肠杆菌中导入了本专利技术中的编码D-木糖酸脱水酶的基因序列。产1,2,4-丁三醇的基因工程菌，该大肠杆菌中导入了D-木糖酸脱水酶基因、D-木糖脱氢酶基因、苯甲酰甲酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因，所述的D-木糖脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.：5所示、苯甲酰甲酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.：6所示、醇脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.：7所示。上述产1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)将D-木糖酸脱水酶基因、D-木糖脱氢酶基因、苯甲酰甲酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因分别克隆至表达质粒中，所述的表达质粒包括BT-62和BT-286，得到重组质粒，(2)再将重组载体转化宿主菌，所述的宿主菌为Trans1T1，得到产1,2,4-丁三醇的基因工程菌。上述产1,2,4-丁三醇的基因工程菌在制备1,2,4-丁三醇中的应用在本专利技术的保护范围之内。本专利技术通过易错PCR对所述来自大肠杆菌的D-木糖酸脱水酶YjhG的基因序列进行易错PCR，通过随机突变改变木糖酸脱水酶(YjhG)基因的密码子，易错PCR随机突变改变YjhG基因的密码子碱基的位置，最终筛选获得具有高木糖酸脱水酶活性的突变株91、96、62、286号。分别提取质粒，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序确定突变的YjhG基因序列。突变株91号(氨基酸序列如SEQIDNO.1所示)第143位碱基由T突变成C，相应的氨基酸由组氨酸突变成苏氨酸，第236位碱基由A突变成G，相应的氨基酸由赖氨酸突变成精氨酸；第520位碱基由G突变成A，相应的氨基酸由丙氨酸突变成苏氨酸；第938位碱基由T突变成C，相应的氨基酸由谷氨酰胺突变成脯氨酸。突变株96号(氨基酸序列如SEQIDNO.2所示)第967位碱基由G突变成A，相应的氨基酸由丙氨酸突变成苏氨酸。突变株62号(氨基酸序列如SEQIDNO.3所示)第967位碱基由G突变成A,相应的氨基酸由丙氨酸突变成苏氨酸，第1855位碱基由G突变成A，相应的氨基酸由天冬氨酸突变成天冬酰胺，第1898位碱基由C突变成T，相应的氨基酸由苏氨酸突变成异亮氨酸。突变株286号(氨基酸序列如SEQIDNO.4所示)第163位碱基由T突变成C，相应的氨基酸由丝氨酸突变成脯氨酸，第203位氨基酸由G突变成A，相应的氨基酸由丝氨酸突变为天冬酰胺，第967位碱基由G突变成A,相应的氨基酸由丙氨酸突变成苏氨酸。有益效果：本专利技术相比于现有技术，具有如下优势：本专利技术应用易错PCR技术对YjhG基因进行随机突变改造，获得几组活力较高的突变株91号、96号、62号和286号，这几个菌株在12h内所消耗木糖酸分别为4.2g/L、4.8g/L、6.22g/L、5.43g/L，而出发菌株(亲株A)在同等条件下消耗的木糖酸为2.15g/L，分别提高了2.1倍、2.4倍、2.89倍、2.5倍。应用易错PCR技术对YjhG基因进行随机突变改造，获得了在以木糖酸为底物时转化效率明显提高的突变菌株，育种目标明确、效率高。附图说明图1第一轮易错PCR复筛后的突变菌株与重组菌株的酶活对比图2第二轮易错PCR初筛后的突变菌株与重组菌株的酶活对比。图3第二轮易错PCR复筛后的突变菌株与重组菌株的酶活对比。图4第二轮易错PCR复筛后的突变菌株产丁三醇的对比。图5第一轮易错PCR复筛后的突变菌株产丁三醇的对比。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例中所用的D-木糖酸脱水酶是来自大肠杆菌的基因，将该基因连接到pCWJ表达载体上，转化至大肠杆菌Trans1T1感受态细胞中，得到的阳性克隆培养至OD600为0.6-1.0，加IPTG终浓度为0.5mmol·L-1，33℃培养12～18h获得。实施例1：含YjhG基因菌株的构建(1)利用YjhG基因5’端和3’端引物引入酶切位点(NcoI和HindⅢ)，对YjhG基因和pCWJ质粒进行双酶切，然后将YjhG基因连接到pCWJ载体上；(2)将上述连接液转入大肠杆菌Trans1T1的感受态细胞(全式金生物技术有限公司)里，涂布在带有50mg/L氯霉抗性的LB平板，37℃过夜培养。(3)挑取平板上生长的单菌落，转接到含有50mg/L氯霉素抗性的LB培养基里，然后提取质粒，再本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.D-木糖酸脱水酶，其特征在于，所述D-木糖酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1～4所示。/n

【技术特征摘要】
1.D-木糖酸脱水酶，其特征在于，所述D-木糖酸脱水酶的氨基酸序列如SEQIDNO.：1～4所示。


2.编码权利要求1所述D-木糖酸脱水酶的基因序列。


3.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒中包含权利要求2所述的基因序列。


4.一种重组细胞，其特征在于，该重组细胞中包含权利要求2所述的基因序列。


5.权利要求1或2所述D-木糖酸脱水酶在制备多元醇中的应用。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的多元醇为1,2,4-丁三醇。


7.一株产1,2,4-丁三醇的基因工程菌，其特征在于，在大肠杆菌中导入了权利要求2所述的编码D-木糖酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，麦丹丹，王昕，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32