一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用，属于基因工程领域。以Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2

【技术实现步骤摘要】
一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及一种产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用，具体涉及整合过表达酿酒酵母来源的sam2、met6、str2基因和培养基优化，属于基因工程领域。

技术介绍

[0002]腺苷蛋氨酸(S
‑
adenosyl
‑
L
‑
methionine，SAM)属于体内生理活性分子，在许多生物甲基化中提供甲基，而且是多胺亚精胺和精胺、金属离子螯合化合物烟胺合成前体，在医疗方面具有重要作用。SAM在生物体中以L
‑
蛋氨酸(L
‑
Met)和ATP为直接前体，由腺苷蛋氨酸合酶催化生成。工业大量生产SAM主要是发酵法，因为发酵法相较于其它生产方法，生产成本低，生产过程简单。
[0003]酿酒酵母是理想的底盘细胞，因其具有充满带负电的聚磷酸盐的液泡，能够富集带正电的SAM，是目前用于工业生产的常用宿主。L
‑
Met是SAM合成的重要前体，L
‑
Met在胞内的积累量将直接影响SAM的生产，目前工业生产最常用的手段是在发酵培养基中添加L
‑
Met。但是，发酵培养基中过量的L
‑
Met抑制酵母生长，培养基中L
‑
Met超过1％会明显抑制产量。代谢通路改造的方式来提高胞内L
‑
Met的积累，能减少外源添加L
‑
Met对菌株的影响，具有重大应用前景。

技术实现思路
r/>[0004]本专利技术要解决的技术问题是通过代谢通路改造，构建高产SAM的酿酒酵母菌株，并对其进行培养基优化，进一步提高其SAM生产水平。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种高产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌，过表达腺苷蛋氨酸合酶基因sam2。
[0006]本专利技术的另一个目的是提供一种高产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌，同时过表达腺苷蛋氨酸基因sam2和酶蛋氨酸合酶基因met6。
[0007]本专利技术的另一个目的是提供一种高产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌，同时过表达腺苷蛋氨酸合酶基因sam2、蛋氨酸合酶基因met6和胱硫醚
‑
γ
‑
合酶基因str2。
[0008]在一种实施例中，sam2、met6、str2基因均来源于酿酒酵母。
[0009]本专利技术的另一个目的是提供一种发酵生产腺苷蛋氨酸的方法，将所述酿酒酵母工程菌接种至发酵培养基中，通过调整碳源和硫源优化发酵过程。
[0010]在一种实施方式中，所述发酵培养基中葡萄糖浓度为50
‑
110g/L。
[0011]在一种实施方式中，所述发酵培养基中Na2S2O3浓度为0
‑
1g/L。
[0012]在一种实施方式中，所述发酵培养基含有：葡萄糖90g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， KH2PO
4 4g/L，K2HPO
4 2g/L，MgSO4·
7H2O 0.5g/L，Na2S2O
3 1g/L，L
‑
Met 1.5g/L。
[0013]本专利技术还要求保护所述酵母工程菌及发酵方法在医疗行业制备肝脏疾病、骨关节炎或神经疾病等药物方面的应用。
[0014]有益效果：
[0015]本专利技术首次通过共表达sam2、met6、str2基因，通过提高胞内L
‑
Met的积累，促进SAM 产量提高，所得重组酿酒酵母菌株在发酵24h后L
‑
Met积累量820.0mg/L，SAM产量为 1070.8mg/L，比酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 2
‑
1C)C0提高9.83倍，生产强度达到44.6mg/L/h，比酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 2
‑
1C)C0显著提高。
[0016]本专利技术通过发酵培养基优化，使上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 2
‑
1C) 工程菌胞内L
‑
Met的积累量为1155.1mg/L，SAM产量达到1465.4mg/L,生产强度为61.0 mg/L/h，与优化之前相比，分别提高了40.8％，36.8％和36.7％。
附图说明
[0017]图1为菌株C0、C1、C2的发酵特性；
[0018]图2为菌株C0、C3、C4的发酵特性；
[0019]图3为菌株C0、C2、C6的发酵特性；
[0020]图4为菌株C7在不同浓度葡萄糖和Na2S2O3条件下的SAM和L
‑
Met产量；
[0021]图5为菌株C6、C7发酵过程中的菌浓(A)、SAM和L
‑
Met产量(B)以及葡萄糖消耗情况。
具体实施方式
[0022]YPD培养基：蛋白胨20g/L，醇母粉10g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基添加20g/L琼脂粉)。
[0023]LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
[0024]HPLC分析腺苷蛋氨酸产量：色谱柱为Hypercil GOLDTM aQ C18(4.6mm
×
250mm)，流动相为：0.01mol
·
L
‑1甲酸铵和3％(v/v)的甲醇水溶液，用甲酸调节pH为3.0，流速1.0mL
·
min
‑1，检测波长254nm，进样量为10μL。采用外标法，根据不同浓度的SAM标准品所对应峰面积所作标准曲线定量样品SAM的含量。
[0025]HPLC分析L
‑
蛋氨酸产量：色谱柱为Hypercil GOLDTM aQ C18(4.6mm
×
250mm)，流动相为：10％(v/v)的甲醇水溶液，流速1.0mL
·
min
‑1，检测波长210nm，进样量为10μL。采用外标法，根据不同浓度的L
‑
Met标准品所对应峰面积所作标准曲线定量样品L
‑
Met的含量。
[0026]生物量检测：取适量检测点的样品稀释至OD600值为0.2
‑
0.8，于600nm处测取吸光度。
[0027]葡萄糖检测：离心后的上清液稀释50倍，使用西尔曼生物传感器测葡萄糖含量。
[0028]实施例1构建含腺苷蛋氨酸合酶、蛋氨酸合酶、胱硫醚
‑
γ
‑
合酶的重组质粒
[0029]一、重组表达载体的构建
[0030](1)酿酒酵母来源腺苷蛋氨酸合酶基因表达质粒的构建
[0031]以sam2F和sam2R为引物，扩增出基因组上的sam2片段，采用BamHI和HindIII双酶切pRS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于过表达腺苷蛋氨酸合酶基因sam2。2.一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于同时过表达腺苷蛋氨酸合酶基因sam2和酶蛋氨酸合酶基因met6。3.一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于同时过表达腺苷蛋氨酸合酶基因sam2、蛋氨酸合酶基因met6和胱硫醚
‑
γ
‑
合酶基因str2。4.权利要求1
‑
3任一所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述腺苷蛋氨酸合酶基因sam2、蛋氨酸合酶基因met6和胱硫醚
‑
γ
‑
合酶基因str2均来源于酿酒酵母。5.应用权利要求4所述酿酒酵母工程菌发酵生产腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于将所述酿酒酵母工程菌接种至发酵培养基中，通过调整碳源和硫源优化发酵过程。6.权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐国强，时相柳，肖文翰，钱建瑛，张晓梅，史劲松，许正宏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：