本发明专利技术公开了一种高效生产视黄酸的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程领域。本发明专利技术以产视黄醛的酵母工程菌株为出发菌，利用基因整合技术或者导入重组表达质粒的方式，使得来源于酿酒酵母的醛脱氢酶编码基因在工程菌株内成功表达，参与到视黄酸的合成，实现以安全、高效的酵母为细胞工厂高效率地生产视黄酸。进一步通过增加拷贝数，并敲除甲羟戊酸途径转录抑制因子编码基因提高视黄酸的产量。利用本发明专利技术构建的工程菌株在摇瓶单相和两相发酵培养后合成视黄酸的产量，优于现有技术报道，具有良好的应用前景。本发明专利技术还提供了一种实现视黄酸胞外分泌的方法，在发酵过程中添加十二烷或橄榄油，使得合成的视黄酸分泌到胞外。胞外。胞外。
【技术实现步骤摘要】
一种高效生产视黄酸的基因工程菌及其构建方法和应用
[0001]本专利技术涉及基因工程、代谢工程和微生物领域，特别涉及一种能实现视黄酸高产的基因工程菌的构建方法和应用。
技术介绍
[0002]视黄酸(又称维甲酸retinoic acid，RA)是动物体内微生物A的代谢中间产物，β
‑
胡萝卜素在肠道被肠粘膜β
‑
胡萝卜素加氧酶氧化生成2个分子的视黄醇(也被广泛称为维生素A)，视黄醇被吸收入体内后被氧化成视黄醛，再进一步被氧化成视黄酸。
[0003]类视黄醇是视黄醇及其衍生物的集合，它以活性代谢物视黄酸(RA)的形式参与各种生理功能，如细胞生长、分化、器官生成、生殖和免疫反应。视黄酸作为核视黄酸受体的配体，在包括皮肤发育在内的许多发育过程中调节靶基因的转录活性，因此视黄酸常用于痤疮和其他皮肤病的临床治疗。
[0004]目前用于制备类视黄醇的化学合成方法具有一些不理想的特性，比如高能耗、复杂的纯化步骤和/或产生副产物。利用微生物进行异源合成是一种经济且环保的方式，目前已在大肠杆菌和酿酒酵母中实现了视黄醛、视黄醇的合成，然而微生物生产视黄酸的研究仍处于初步阶段。
[0005]迄今为止，关于视黄酸生物合成的研究报道是以大肠杆菌作为宿主，通过表达Hep3B细胞系的醛脱氢酶(Raldh)实现的(Han,M.,Lee,P.C.Microbial Production of Bioactive Retinoic Acid Using Metabolically Engineered Escherichia coli.Microorganisms,2021,9:1520
‑
1532.)。然而，该酶催化视黄醛氧化生成视黄酸的效率不足，其编码基因的引入仅产生了0.59mg/L视黄酸，虽然后续利用其他策略将视黄酸滴度提高到了3.46
±
0.16mg/L，但视黄酸的产量仍非常有限。另外，利用大肠杆菌生产视黄酸还存在噬菌体污染、内毒素残留等风险。
[0006]因此，找到具有转化视黄醛为视黄酸功能且催化效率更优异的醛脱氢酶并利用生物安全性更高的酵母为底盘通过异源合成方式高效制备酸形式的维生素A是本领域技术人员需要解决的首要难题。同时，探究两相培养技术使胞内合成的视黄酸分泌并集中到有机相来简化视黄酸的制备流程是当前技术人员面临的另一个问题。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的在于提供一种能够实现视黄酸高效生产的基因工程菌，利用微生物异源合成方式高效制备酸形式的维生素A。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种高效生产视黄酸的基因工程菌，所述基因工程菌以产视黄醛的酵母工程菌株为出发菌，其染色体上整合了醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase)编码基因；
[0010]或者，所述基因工程菌以产视黄醛的酵母工程菌株为出发菌，宿主菌内含有包含
了醛脱氢酶编码基因的重组表达质粒；
[0011]所述醛脱氢酶编码基因来源于酿酒酵母。
[0012]本专利技术利用基因整合技术或者导入重组表达质粒的方式，使得醛脱氢酶在产视黄醛的酵母工程菌株内成功表达，参与到视黄酸的合成，实现以安全、高效的酵母为细胞工厂高效率地生产视黄酸。
[0013]本专利技术以酵母作为异源合成视黄酸的底盘细胞，生物安全性高。所述醛脱氢酶编码基因源自酿酒酵母，整合同源基因有利于该酶成功表达，研究表明，表达的醛脱氢酶具有较高催化活性，实现视黄酸的高效合成。
[0014]所述产视黄醛的酵母工程菌株为公众可获得材料，其构建方法参考文献(Hu,Q.,Zhang,T.,Yu,H.,et al.Selective biosynthesis of retinol in S.cerevisiae.Bioresources and Bioprocessing.2022.9:1
‑
14.)。优选的，所述出发菌选用上述文献中构建的产视黄醛的酿酒酵母Y03。
[0015]作为优选，所述醛脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因克隆自酿酒酵母基因组。
[0016]作为优选，所述醛脱氢酶编码基因的拷贝数为1～4个。为进一步提高视黄酸产量，可增加整合到工程菌株中醛脱氢酶编码基因的拷贝数。
[0017]作为优选，所述基因工程菌的甲羟戊酸途径转录抑制因子(MOT3)基因被敲除。研究表明，当基因工程菌中甲羟戊酸途径转录抑制因子基因被抑制，视黄酸的产量显著提升。
[0018]本专利技术还提供了一种构建所述高效生产视黄酸的基因工程菌的方法，所述方法包括：以产视黄醛的酵母工程菌株为出发菌，通过整合质粒将若干个拷贝的醛脱氢酶编码基因整合到工程菌株染色体上，获得高效生产视黄酸的基因工程菌；
[0019]或者，以产视黄醛的酵母工程菌株为宿主菌，导入包含了醛脱氢酶编码基因的重组表达质粒。
[0020]优选的，利用基因整合或者导入重组表达质粒的方式将内源醇脱氢酶编码整合到酿酒酵母细胞内，使得相应的酶在产视黄醛的酿酒酵母中成功表达，构建了视黄酸生产的酿酒酵母。
[0021]进一步的，再利用同源重组技术敲除甲羟戊酸途径转录抑制因子基因。
[0022]具体的，本专利技术提供了一种整合四个拷贝醛脱氢酶编码基因，并敲除MOT3基因的重组菌的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
[0023](1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI
‑
DPP1的P
GAL7
后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI
‑
DPP1
‑
HFD1；
[0024](2)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI
‑
DPP1
‑
HFD1的P
GAL2
后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI
‑
DPP1
‑
HFD1
‑
HFD1；
[0025](3)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI
‑
MOT3的P
GAL1
后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI
‑
MOT3
‑
HFD1；
[0026](4)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI
‑
MOT3
‑
HFD1的P
GAL10
后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI
‑
MOT3
‑
HFD1
‑
HFD1；
[0027](5)依次将重组质粒pUMRI
‑
MOT3
‑
HFD1
‑
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高效生产视黄酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以产视黄醛的酵母工程菌株为出发菌，其染色体上整合了醛脱氢酶编码基因；或者，所述基因工程菌以产视黄醛的酵母工程菌株为出发菌，宿主菌内含有包含了醛脱氢酶编码基因的重组表达质粒；所述醛脱氢酶编码基因来源于酿酒酵母。2.如权利要求1所述的高效生产视黄酸的基因工程菌，其特征在于，所述醛脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1或2所述的高效生产视黄酸的基因工程菌，其特征在于，所述醛脱氢酶编码基因的拷贝数为1～4个。4.如权利要求1或2所述的高效生产视黄酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的甲羟戊酸途径转录抑制因子基因被敲除。5.如权利要求1所述的高效生产视黄酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括：以产视黄醛的酵母工程菌株为出发菌，通过整合质粒将若干个拷贝的醛脱氢酶编码基因整合到工程菌株染色体上，获得高效生产视黄酸的基因工程菌；或者，以产视黄醛的酵母工程菌株为宿主菌，导入包含了醛脱氢酶编码基因的重组表达质粒。6.如权利要求5所述的高效生产视黄酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI
‑
DPP1的P
GAL7
后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI
‑
DPP1
‑
HFD1；(2)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI
‑
DPP1
‑
HFD1的P
GAL2
后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI
‑
DPP1
‑
HFD1
‑
HFD1；(3)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI
‑...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶丽丹，于洪巍，胡琼越，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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