药用核酸合成工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种药用核酸合成工艺，本发明专利技术在合成过程中尽可能的将不需要的基团暂时保护起来，在一轮偶联反应之后，再将上一轮基团上的保护基选择性的脱下来，以形成专一的磷酸二酯键，从而尽可能减少副反应，提升目的产物的产率，降低纯化难度。本发明专利技术能够通过对合成柱进行简单的改造，从而能够实现在氨解过程中不对合成柱进行转移，在线氨解，将合成柱内的固相负载物表面负载的寡核酸产品洗脱，对含有寡核酸产品的洗脱液收集并进行后续的纯化处理工序，由于整个过程合成柱无需下线，从而一方面大大降低了工作难度与复杂程度，另一方面显著降低了拆卸安装过程中的废气泄露。面显著降低了拆卸安装过程中的废气泄露。面显著降低了拆卸安装过程中的废气泄露。

【技术实现步骤摘要】
药用核酸合成工艺


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体的，涉及一种药用核酸合成工艺。

技术介绍

[0002]药用核酸广泛应用于小核酸药物开发和新型疫苗佐剂的开发。近些年，以核酸治疗为技术基础的第三代药物发展迅猛，核酸药物的特点在于它们可以直接与致病基因结合并阻止其翻译，从而防止致病蛋白质生产，较小分子药物和蛋白抗体药物，核酸药物能够精准制导，直达靶点，且易于工业化放大生产。
[0003]在药用核酸的生产过程中，其骨架是相邻核苷酸间的3
’→5’
磷酸二酯键，然后由于核苷酸为一个多官能基团的分子，且人工化学合成核酸分子是一个多步连续的反应，因此在反应过程中副反应较多，从而会显著降低目标产物的产率，提升纯化难度，降低了生产效率与产品质量，因此在实际生产过程中需要抑制副反应的发生以达到提升目标产物产率，降低纯化难度，提升生产效率的效果，为了解决上述问题，本专利技术提供了以下技术方案。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种药用核酸合成工艺解决现有技术中药用核酸制备过程中副产物多影响纯化结果与纯化效率的问题。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006]一种药用核酸合成工艺，包括如下步骤：
[0007]第一步，将配制好的原料加入全自动合成仪中，在常温、全封闭的条件下进行合成操作，整个合成周期为24小时；
[0008]链的延长反应过程从3
’‑5’
方向延伸，包含脱保护、活化偶联、硫化/氧化、盖帽4步反应；待4步反应完成后，再进行下一轮的链的延长反应；
[0009]所述脱保护反应包括：用二氯乙酸脱去核苷酸上的保护基团DMT，得5
’‑
羟基端即核苷酸单体，供下一步偶联；
[0010]所述活化偶联反应包括：在偶联之前，亚磷酰胺保护的5
’‑
羟基端与活化剂乙硫基四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3
’
端被活化，5
’‑
羟基被DMT保护，与溶液中游离的5
’‑
羟基发生缩合反应；
[0011]所述硫化/氧化反应包括：在硫化试剂苯乙酰二硫化物或氧化剂碘液的作用下，亚磷酰形式转变为磷酸三酯；
[0012]所述盖帽反应包括：用乙酸酐终止5
’‑
羟基后续发生反应；
[0013]第二步，胺洗；
[0014]第三步，氨解；
[0015]第四步，纯化；
[0016]第五步，超滤；
[0017]第六步，冻干，得到成品。
[0018]作为本专利技术的进一步方案，硫化反应与氧化反应在单个链延长反应过程中不同时进行，在单个批次生产过程中反应次数相同。
[0019]作为本专利技术的进一步方案，活化偶联反应中，乙硫基四氮唑过量。
[0020]作为本专利技术的进一步方案，胺洗采用二乙胺对产品进行冲洗，脱出保护基团氰乙基的目的，胺洗过程二乙胺、乙腈混合液冲洗时间约为10min。
[0021]作为本专利技术的进一步方案，胺洗完成后采用乙腈对合成仪以及合成仪中的合成柱进行清洗。
[0022]作为本专利技术的进一步方案，氨解是将合成柱中反应后产品与固相载体一起转入氨解罐中，采用氮气将25％氨水压送至氨解罐，将固相支持物上合成的寡核酸洗脱，再将含寡核酸产品的氨水通过氮气密闭管道压至移动罐中。
[0023]作为本专利技术的进一步方案，合成柱的两端分别安装进水口与出水口，并在合成柱的两端分别设置一个阀门，进水口与出水口上同样设置有阀门，在进行氨解时，关闭合成柱两端的阀门，通过氮气将25％氨水由储桶压送至合成柱，将固相支持物上合成的寡核酸洗脱下来，再将含寡核酸产品的氨水通过合成柱的出水口排出并压送至移动罐中。
[0024]作为本专利技术的进一步方案，纯化方法包括离子交换法与反相层析法。
[0025]作为本专利技术的进一步方案，超滤前采用质量比16％NaOH溶液对超滤膜进行润洗，润洗完成后采用注射水进行置换脱盐。
[0026]本专利技术的有益效果：
[0027](1)核酸分子的基本骨架是相邻核苷酸间的3
’→5’
磷酸二酯键，由于核苷酸为一个多官能基团的分子，且人工化学合成核酸分子是一个多步连续的反应，因此本专利技术在合成过程中尽可能的将不需要的基团暂时保护起来，在一轮偶联反应之后，再将上一轮基团上的保护基选择性的脱下来，以形成专一的磷酸二酯键，从而尽可能减少副反应，提升目的产物的产率，降低纯化难度。
[0028](2)本专利技术能够通过对合成柱进行简单的改造，从而能够实现在氨解过程中不对合成柱进行转移，在线氨解，将合成柱内的固相负载物表面负载的寡核酸产品洗脱，对含有寡核酸产品的洗脱液收集并进行后续的纯化处理工序，由于整个过程合成柱无需下线，从而一方面大大降低了工作难度与复杂程度，另一方面显著降低了拆卸安装过程中的废气泄露。
附图说明
[0029]下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。
[0030]图1是本专利技术合成板的结构示意图；
[0031]图2是本专利技术合成板的结构示意图；
[0032]图3是本专利技术调节连接管的结构示意图；
[0033]图中：1、上封板；2、下封板；3、气压调节区域；4、合成柱结构；5、调节连接管；11、进料圆孔；51、通气管；52、管体；53、密封挡圈；54、螺纹区。
具体实施方式
[0034]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施
例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0035]一种药用核酸合成工艺，包括如下步骤：
[0036]第一步，将配制好的原料加入全自动合成仪中，在常温、全封闭的条件下进行合成操作，整个合成周期为24小时。
[0037]合成仪设合成柱350mm、600mm、800mm；
[0038]链的延长反应过程是从3
’‑5’
方向延伸，主要包含脱保护、活化偶联、硫化/氧化、盖帽4步反应；待4步反应完成后，再进行下一轮的链的延长反应，链的延长反应次数根据需求设定；
[0039]其中硫化反应与氧化反应在单个链延长反应过程中不同时进行，在单个批次生产过程中反应次数相同；
[0040]所述脱保护反应包括：用二氯乙酸脱去核苷酸上的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得5
’‑
羟基端(核苷酸单体)，供下一步偶联；
[0041]方程式如下：核苷单体+二氯乙酸
→5’‑
羟基端+二甲氧基三苯甲基+二氯乙酸根；
[0042][0043]所述活化偶联反应包括：在偶联之前，核苷酸单体与四唑混合并进入合成柱，此时四唑提供一个质子给磷酸上二异丙胺基的N原子，质子化的二异丙胺是一个良好的游离基团，与四本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.药用核酸合成工艺，其特征在于，包括如下步骤：第一步，将配制好的原料加入全自动合成仪中，在常温、全封闭的条件下进行合成操作，整个合成周期为24小时；链的延长反应过程从3
’‑5’
方向延伸，包含脱保护、活化偶联、硫化/氧化、盖帽4步反应；待4步反应完成后，再进行下一轮的链的延长反应；所述脱保护反应包括：用二氯乙酸脱去核苷酸上的保护基团DMT，得5
’‑
羟基端即核苷酸单体，供下一步偶联；所述活化偶联反应包括：在偶联之前，亚磷酰胺保护的5
’‑
羟基端与活化剂乙硫基四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3
’
端被活化，5
’‑
羟基被DMT保护，与溶液中游离的5
’‑
羟基发生缩合反应；所述硫化/氧化反应包括：在硫化试剂苯乙酰二硫化物或氧化剂碘液的作用下，亚磷酰形式转变为磷酸三酯；所述盖帽反应包括：用乙酸酐终止5
’‑
羟基后续发生反应；第二步，胺洗；第三步，氨解；第四步，纯化；第五步，超滤；第六步，冻干，得到成品。2.根据权利要求1所述的药用核酸合成工艺，其特征在于，硫化反应与氧化反应在单个链延长反应过程中不同时进行，在单个批次生产过程中反应次数相同。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宗文，钱鑫，潘红，刘倩，李孝才，朱桃花，
申请(专利权)人：通用生物滁州有限公司，
类型：发明
国别省市：