NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒。本发明专利技术还涉及SEQ ID No.1所示的基因序列在区分人源NK细胞和非人源动物基因中的特异性应用。通过提出特异性DNA序列，可以特异性区分人源NK细胞来源的DNA序列和非人源动物基因来源的DNA序列，并基于该特异性DNA序列构建区分人源NK细胞基因和非人源动物基因的qPCR体系，为NK细胞及其衍生细胞治疗类产品提供引物对和探针组，并成功设计一种NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒，从而为NK细胞及其衍生细胞治疗类产品的临床前研究提供便利。品的临床前研究提供便利。品的临床前研究提供便利。

【技术实现步骤摘要】
NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒
[0001]NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒。


[0002]本专利技术涉及生物分布分析、药代动力学、毒代动力学、细胞治疗药物安全性评价和临床前研究领域，尤其涉及一种NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒。

技术介绍

[0003]自然杀伤细胞(Natural Killer cell, NK细胞)来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布在骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。NK细胞不同于T细胞和B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。近年来，伴随着细胞基因治疗领域的不断发展，T细胞被生物医药领域研究人员开发成嵌合抗原受体T细胞免疫疗法( Chimeric Antigen Receptor T
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Cell Immunotherapy, CAR
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T)治疗产品，NK细胞的治疗作用也备受关注。目前已经有各种各样的NK细胞改造型产品被用于医药研发，例如基于病毒载体转导的细胞构建CAR
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NK，或基于胞外偶联方式构建CAR
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NK的细胞治疗产品，双靶点或多靶点CAR
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NK，基因编辑的NK细胞类产品。
[0004]细胞治疗的NK类产品离不开临床前的药代动力学和生物分布研究。对于病毒载体导入在NK细胞上表达的CAR可以基于转入基因即CAR部分的序列进行特异性检测。当前常用的技术手段是对每一个新的CAR
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NK根据CAR序列分别基于qPCR技术检测特定的CAR，可是，基于转入基因的检测方式对于每一个转入基因针对不同的分子都需要构建独立的qPCR检测方法，这造成早期临床前研究的工作量巨大，也需要耗费较长的时间，对快速推进早期研究具有不利的时间成本。因此，建立通用的且特异性地直接区分人源NK细胞和实验动物如小鼠来源的基因组DNA的方法体系，可以为临床前研究提供快捷和便利，具有重要的工业价值和经济效益。
[0005]另外，对于细胞外直接偶联CAR部分的CAR
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NK或其它改造型的NK细胞治疗产品，并不适合基于CAR序列构建qPCR的方法。例如直接偶联的CAR，CAR本身就已经表达成蛋白性质的成品进行偶联，因此DNA层面的仅基于CAR的检测方法则不再适用。为了表征NK本身的药代动力学和生物分布行为，必须基于NK细胞本身基因序列构建能特异性区分人源NK细胞的基因和动物基因的定量PCR方法。如何找到特异的DNA序列进行上述区分是本领域经常碰到的难题。具体来说，虽然CD56分子是NK细胞表面的标志性分子，但实际上此分子的基因在小鼠和人NK细胞甚至其它细胞或组织均存在。找到怎样的基因特异性序列应用于NK细胞药代与分布，并成功构建对应的检测方法是本领域人员一直面对的重要挑战。

技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利技术创新性地找到并提出特异性DNA序列，可以特异性区分人源NK细胞来源的DNA序列和非人源动物基因来源的DNA序列，并基于该特异性DNA序列构建区
分人源NK细胞基因和非人源动物基因的qPCR体系，为NK细胞及其衍生细胞治疗类产品提供引物对和探针组，并成功设计一种NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒，从而为NK细胞及其衍生细胞治疗类产品的临床前研究提供便利。具体地，本专利技术需要解决以下方面的技术问题：1. 特异性，尤其是在成千上万的人NK细胞的基因中找到与动物例如小鼠差异性表达的基因序列。NK细胞基因组和动物基因组都有成千上万的基因，寻找差异性表达基因不仅需要大量比对调研，还要进行严谨的试验验证，这样才能确定其是否能够区分差异存在的序列。qPCR技术仅是一种技术方式或技术载体，qPCR技术与特异的基因序列结合才能实现其完整应用和实际的应用价值。若能实现NK细胞的药代动力学分析与分布生物分析，必须先找到特异性序列，再基于特异性序列设计qPCR方法。
[0007]2. 方法学设计。怎样基于qPCR定量检测DNA的技术，针对个性化的特异性差异表达基因序列进行方法学设计，包括引物、探针设计和目标序列选择。
[0008]3. 反应体系的设置。例如反应体系中各反应成分与比例的控制与优化。
[0009]4. 反应体系中关键性缓冲液（Buffer）的应用。相较于基础科研，本专利技术立足于工业应用，成分变化可能对试剂盒的使用产生影响，所以本专利技术的反应体系并非像基础科研那样直接用水处理或稀释样品即可，而是需要精密和严谨的分析体系，强调各细节变化，保证方法和试剂盒满足实际的试验验证。
[0010]5. 反应条件的确定。反应条件包括预变性、变性、退火和延伸的温度以及时间的控制。
[0011]6. 优化各种条件，尤其是要提高方法学的灵敏度和扩增效率。例如，克服不同个体不同基质来源的模板（即基因组DNA）提取液中的基质成分干扰。
[0012]第一方面，本专利技术提供SEQ ID No.1 所示的基因序列在区分人源NK细胞和非人源动物基因中的特异性应用。
[0013]第二方面，本专利技术提供SEQ ID No.1 所示的基因序列在制备NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒中的应用。
[0014]第三方面，本专利技术提供用于特异性区分人源NK细胞和非人源动物基因的引物对。所述引物对用于扩增SEQ ID No.1所示的目标基因序列；所述引物对由Primer
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F正向引物和Primer
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R反向引物组成；所述Primer
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F正向引物为SEQ ID No.2所示引物，或者将SEQ ID No.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID No.2具有相同功能的DNA分子；所述Primer
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R反向引物为SEQ ID No.3 所示引物，或者将SEQ ID No.3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID No.3具有相同功能的DNA分子。
[0015]较佳地，所述正向引物和反向引物的解链温度独立地为55
±
1℃。
[0016]较佳地，所述正向引物和反向引物的解链温度差值不超过2℃。如果正向引物和反向引物的解链温度差值过高，会导致退火不同步。
[0017]第四方面，本专利技术提供用于特异性区分人源NK细胞和非人源动物基因的引物对在制备NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒中的应用。
[0018]第五方面，本专利技术提供用于特异性区分人源NK细胞和非人源动物基因的引物探针组。所述引物探针组包括SEQ ID No.4所示的基因序列在5
´
端偶联发光基团和3
´
端偶联淬灭基团的Taqman探针以及上述任一项所述的引物对。
[0019]较佳地，探针的解链温度为65
±
1℃。
[0020]较佳地，探针的解链温度高于Primer<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.SEQ ID No.1 所示的基因序列在区分人源NK细胞和非人源动物基因中的特异性应用。2.SEQ ID No.1 所示的基因序列在制备NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒中的应用。3.用于特异性区分人源NK细胞和非人源动物基因的引物对，其特征在于，所述引物对用于扩增SEQ ID No.1所示的目标基因序列；所述引物对由Primer
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F正向引物和Primer
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R反向引物组成；所述Primer
‑
F正向引物为SEQ ID No.2所示引物，或者将SEQ ID No.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID No.2具有相同功能的DNA分子；所述Primer
‑
R反向引物为SEQ ID No.3 所示引物，或者将SEQ ID No.3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID No.3具有相同功能的DNA分子。4.根据权利要求3所示的引物对，其特征在于，所述正向引物和反向引物的解链温度独立地为55
±
1℃。5.根据权利要求3所示的引物对，其特征在于，所述正向引物和反向引物的解链温度差值不超过2℃。6.权利要求3至5中任一项所述的用于特异性区分人源NK细胞和非人源动物基因的引物对在制备NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒中的应用。7.用于特异性区分人源NK细胞和非人源动物基因的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括SEQ ID No.4所示的基因序列在5
´
端偶联发光基团和3
´
端偶联淬灭基团的Taqman探针以及权利要求3至5中任一项所述的用于特异性区分人源NK细胞和非人源动物基因的引物对。8.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：章登吉，袁雨琼，白振振，梁冉冉，陈春麟，朱焕章，
申请(专利权)人：美迪西普胜医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：