一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法。所述检测试剂盒包括：组分A：预先包被链霉亲和素的微孔酶标板；组分B：GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水或者纯化的GNP单克隆抗体；组分C：生物素偶联的GNP多肽；组分D：用于稀释纯化的GNP单克隆抗体或者GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水的样品稀释液；组分E：用于稀释生物素偶联的GNP多肽的分析缓冲液；组分F：GNP标准品；组分G：辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG；组分H：用于稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG的抗体稀释液；组分G：TMB底物；组分I：终止液。本发明专利技术基于有限的抗原表位构建竞争性的分析方法，成功构建了GNP多肽的检测试剂盒。成功构建了GNP多肽的检测试剂盒。成功构建了GNP多肽的检测试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于药物分析领域，涉及GNP多肽的药代动力学和毒代动力学研究领域，具体涉及一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]GNP多肽，也可以称为“G型利钠肽”或者“GNP”，最初在非洲东部地区的一种窄头树眼镜蛇毒液中发现，是与BNP相似的天然类似物，也是利钠肽家族的新成员，具有极高药用价值。GNP多肽的一级结构中含有38个氨基酸序列，分子量约为3689Da。GNP比BNP相差6个氨基酸，且同源性差异很大，仅48.3%的同源性，但是可以发挥类似于BNP的作用，例如增加靶细胞环鸟苷酸的水平，促进平滑肌细胞舒张，促使静脉和动脉血管扩张，发挥利尿钠、利尿、血管扩张、平滑肌松弛的作用。目前国内外许多药物公司开发GNP多肽，且主要通过合成途径制作GNP多肽。但是当前尚未有相关报道涉及GNP多肽的检测方法，市场上也没有提供对应的GNP多肽检测试剂盒。基于GNP多肽药物分子的研发需求，构建GNP多肽的检测试剂盒及检测方法迫在眉睫。
[0003]如上所述，GNP是新发现的外源性多肽分子，GNP与内源的BNP相比不仅相差了6个氨基酸数目，而且序列上同源性很小，仅48.3%的同源性，无表位重叠性可言，GNP和BNP在来源和结构上的差异都决定BNP的检测对GNP完全无可参照性。另有脑利钠肽前体是BNP的前体物质，与GNP也属于不一样的功能物质，其氨基酸数目是76个，远远大于GNP，分子量大，潜在表位相对多，因此对脑利钠肽前体而言容易制备纯化抗体，更可以构建双抗体夹心的检测模式。但是本专利技术针对的GNP多肽是小肽，氨基酸数目相较GNP前体肽而言少一半，GNP多肽和脑利钠肽前体无论是来源、结构大小、检测试剂开发难易均也不具备可比拟性和参照性。总之，本专利技术是要针对一个新的非内源性来源的多肽构建检测试剂盒和检测方法。

技术实现思路

[0004]GNP检测试剂盒的开发完全是针对一个不同的新的肽类分子。无论是抗体制备纯化、分子标记，还是检测缓冲液（Assay Format）的构建都是所要面临的全新技术性问题和实施过程中必须克服的技术性挑战。总体而言，当前构建GNP多肽的检测试剂盒及检测方法主要存在以下技术问题：（1）GNP主要用于治疗心脑血管类疾病，给药剂量很低，通常是ug/kg级别，因此GNP多肽的检测试剂盒对灵敏度要求极高，需要达到纳克级以下，且检测方法在药物分析实践中需要涵盖多个半衰期，还要兼顾小动物实验中样品量少的特点。
[0005]（2）GNP作为小肽物质，不稳定性突出，尤其是未经任何修饰的GNP裸肽在血液和缓冲液（例如分析缓冲液）中极不稳定，故在检测试剂盒的构建过程中需要克服其不稳定性。
[0006]（3）GNP仅含38个氨基酸，属于很短的小肽，表位非常有限，对其标记存在极高难度，相应的抗体也难以制备，这使得双抗体夹心法难以用于GNP检测试剂盒的构建，这无疑进一步增加了使得该检测试剂盒实现良好检测效果的难度。
[0007]针对上述问题，本专利技术提供一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法，既可以达到很高的灵敏度，提高信号，还可以在样品用量少于常规用量（50~100μL）的情况下，获得良好的检测效果。
[0008]第一方面，本专利技术提供一种GNP多肽的检测试剂盒。所述检测试剂盒包括：组分A：预先包被链霉亲和素的微孔酶标板；组分B：GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水或者纯化的GNP单克隆抗体；组分C：生物素偶联的GNP多肽；组分D：用于稀释纯化的GNP单克隆抗体或者GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水的样品稀释液；组分E：用于稀释生物素偶联的GNP多肽的分析缓冲液；组分F：GNP标准品；组分G：辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG；组分H：用于稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG的抗体稀释液；组分G：TMB底物；组分I：终止液。
[0009]本专利技术基于有限的抗原表位构建竞争性的分析方法，区别于常规使用抗原直接包被酶标板，而是预先使用链霉亲和素（Streptavidin）包被微孔板，然后利用生物素（例如biotin）标记的GNP抗原实现间接包被。这样促使GNP反应不受空间位阻的限制，有利于抗原
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抗体的结合反应。而且在没有充分可利用的纯化单克隆抗体的情况下，本专利技术还可以采用直接构建腹水的方法，腹水中单克隆抗体浓度高，不经纯化其抗体活性也不易受到损失，有利于提高反应的信号窗口，进一步也利于促进灵敏度。
[0010]此外，值得说明的是，本专利技术所述试剂盒针对的是GNP多肽。如
技术介绍
中所述，GNP多肽为眼镜蛇毒液中提取物，纯外源性物质，并非人体本身所含物质。因此该试剂盒所检测的物质非人体自身可分泌的内源性物质。
[0011]较佳地，所述样品稀释液每升中包括：酪蛋白 4.5~5.5g，两性表面活性剂 2~3g，MgCl
2 9~10g，γ
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球蛋白 2~2.5g，NaCl20.5~29g，0.5M 的EDTA溶液8~15mL，动物血清 8~15mL，吐温
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20 450~550μL。
[0012]较佳地，所述分析缓冲液为牛血清蛋白
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海藻糖
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PBST溶液。例如，所述分析缓冲液每升中包括：0.001~0.005g/mL的牛血清蛋白，0.001~0.005g/mL的海藻糖，0.001~0.005mL/mL的吐温
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20，余量为磷酸盐缓冲溶液。
[0013]较佳地，所述抗体稀释液为酪蛋白
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PBS溶液。例如抗体稀释液每升中包括：0.01~0.05g/mL的酪蛋白，余量为磷酸盐缓冲溶液。
[0014]本专利技术成功构建了GNP多肽的药代动力学检测试剂盒，并取得非常好的实施效果，在药物分析领域尤其是在GNP药物开发的药代动力学和毒代动力学研究领域具有很好的实用价值。不仅如此，本专利技术的检测试剂盒还可以兼顾不同种属，特别是采集量有限的大鼠、小鼠血清样品，本专利技术的检测方法可以在样品用量少于常规用量的情况下仍然实现高精度检测。值得一提的是，本专利技术在构建检测试剂盒的过程中，调制出多种新型缓冲液（Buffer）配方，有利于消除基质干扰、非特异性信号，同时兼顾GNP和标记的GNP多肽的稳定性。这也是本专利技术首次提出并实现。
[0015]分子标记时，标记物要通过一定的基团和被标记物结合。太小的小肽上可与标记物结合的基团很少。GNP上仅两个赖氨酸，生物素标记主要依赖于赖氨酸，且分子量太小使得很难将标记分子和标记物分离开来。较佳地，所述生物素偶联的GNP多肽为N端起10号位及30号位氨基酸。这解决了GNP多肽（属于小肽）难以标记的问题。
[0016]第二方面，本专利技术还提供了一种GNP多肽的检测方法。可将上述任一项所述的GNP多肽的检测试剂盒用于该GNP多肽的检测方法。所述检测方法包括以下步骤：步骤（1）、在酶标板上预先包被链霉亲和素并封闭以制备固相载体；步骤（2）、将生物素偶联的GNP多肽结合在固相载体上形成固相化抗原；步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：组分A：预先包被链霉亲和素的微孔酶标板；组分B：GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水或者纯化的GNP单克隆抗体；组分C：生物素偶联的GNP多肽；组分D：用于稀释纯化的GNP单克隆抗体或者GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水的样品稀释液；组分E：用于稀释生物素偶联的GNP多肽的分析缓冲液；组分F：GNP标准品；组分G：辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG；组分H：用于稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG的抗体稀释液；组分G：TMB底物；组分I：终止液。2.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液每升中包括：酪蛋白 4.5~5.5g，两性表面活性剂 2~3g，MgCl
2 9~10g，γ
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球蛋白 2~2.5g，NaCl
2 0.5~29g，0.5M 的EDTA溶液8~15mL，动物血清 8~15mL，吐温
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20 450~550μL。3.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述分析缓冲液为牛血清蛋白
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海藻糖
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PBST溶液。4.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述抗体稀释液为酪蛋白
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PBS溶液。5.根据权利要求1所述的GNP多肽的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素偶联的GNP多肽为N端起10号位及30号位氨基酸。6.GNP多肽的检测方法，其特征在于，所述GNP多肽的检测方法使用权利要求1至5中任一项所述的GNP多肽的检测试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：步骤（1）、在酶标板上预先包被链霉亲和素并封闭以制备固相载体；步骤（2）、将生物素偶联的GNP多肽结合在固相载体上形成固相化抗原；步骤（3）、将标准品、质控品、受试血清样本加入酶标板，随后同步加入GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水或者纯化GNP单克隆抗体进行孵育，受试血清样本中的游离态GNP与生物素偶联的GNP竞争结合腹水或纯化GNP单克隆抗体上的位点，以在固相载体上形成抗原抗体复合物；步骤（4）、向步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：章登吉，陈春麟，任朋亮，周舟扬，张路路，章春燕，
申请(专利权)人：美迪西普胜医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：