一种利用实时荧光PCR定量检测胶孢炭疽菌的方法技术

本发明专利技术提出了一种利用实时荧光PCR定量检测胶孢炭疽菌的方法；通过胶孢炭疽菌的肌动蛋白基因设计的引物，建立了胶孢炭疽菌的实时荧光定量PCR检测方法；本发明专利技术检测方法的特异性和灵敏度高，还可检测出处于潜伏期的胶孢炭疽菌，对于检测潜在的胶孢炭疽菌感染具有重要意义；本发明专利技术的检测方法还考虑了病原菌DNA与植物DNA生物量之间的归一化关系，能够准确地测定胶孢炭疽菌在不同寄主植物中的生长情况，可用于拟南芥和柱花草抗病品种的筛选和鉴定，对胶孢炭疽菌的早期检测和及时防治提供依据。胶孢炭疽菌的早期检测和及时防治提供依据。胶孢炭疽菌的早期检测和及时防治提供依据。

【技术实现步骤摘要】
一种利用实时荧光PCR定量检测胶孢炭疽菌的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种利用实时荧光PCR定量检测胶孢炭疽菌的方法。

技术介绍

[0002]传统上，病原菌感染的诊断依赖于病原菌的分离、培养，耗时较长且消耗人力。而对于植物病原菌的检测最简单的方法就是视觉疾病症状的评估，但可见的病变通常发生在宿主
‑
病原菌相互作用的后期，这使得在对炭疽病的早期防治变得困难。
[0003]随着基因组学时代的发展，实时荧光定量PCR已经发展成为一种能够快速识别病原体和诊断疾病的方法。比如，洪彦涛等通过RT
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PCR检测禾谷丝核菌肌动蛋白(actin)基因在小麦中的相对表达量来鉴定不同小麦品种对病原菌的抗性[洪彦涛,张增艳.利用荧光定量PCR检测禾谷丝核菌的相对生物量[J].植物保护,2015,41(01):116
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121.]。然而与禾谷丝核菌相比，胶孢炭疽菌能侵染的寄主广泛分布，特别是在热带和亚热带作物地区，包括草莓、芒果、辣椒、番茄、木薯、石榴、柱花草和巴西橡胶树等，且禾谷丝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用实时荧光PCR定量检测胶孢炭疽菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据胶孢炭疽菌的保守区域ACT基因序列设计得到两对引物，分别为ACT3F/ACT3R和ACT4F/ACT4R；(2)提取胶孢炭疽菌的gDNA，得胶孢炭疽菌gDNA；(3)将步骤(2)提取得到的gDNA稀释，以稀释后的gDNA为模板，使用引物进行实时荧光PCR，建立阈值循环与模板浓度对数之间的线性回归曲线；(4)提取待测样品的DNA，使用引物，通过实时荧光定量PCR检测待测样品，将得到CT值代入步骤(3)的线性回归曲线中，得到胶孢炭疽菌的含量。2.根据权利要求1所述的利用实时荧光PCR定量检测胶孢炭疽菌的方法，其特征在于，所述ACT3F为5
’‑
AGAGCTGTCTTCCGTAAGTCCC
‑3’
；所述ACT3R为5
’‑
AGCACACGCCGGTTGATGACC
‑3’
。3.根据权利要求1所述的利用实时荧光PCR定量检测胶孢炭疽菌的方法，其特征在于，所述ACT4F为5
’‑
GCCCAGAGCTGTCTTCCGT
‑3’
；所述ACT4R为5
’‑
GCGAGAAGCAGACATACCCAT
‑3’
。4.根据权利要求1所述的利用实时荧光PCR定量检测胶孢炭疽菌的方法，其特征在于，所述实时荧光PCR的反应体系的总体积为20μl，具体包括：2
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ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix 10μL；Sterile deionized water 7.2μL；引物混合物，摩尔浓度为10μM each，最终摩尔浓度为0.4μM each，4μL；模板DNA 2μL。5.根据权利要求1所述的利用实时荧光PCR定量检测胶孢炭疽菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗丽娟，蒋凌雁，万敉町，陈银华，王红刚，杨丽云，张世子，吴远航，高静，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：