一种基于PEDF/LDLR双基因敲除的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于PEDF/LDLR双基因敲除的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型构建方法及应用，属于医药技术领域。本发明专利技术采用高脂饮食诱导PEDF/LDLR双基因敲除小鼠发生非酒精性脂肪性肝炎表型，所构建的动物模型表现出肥胖、高血脂、胰岛素抵抗、高血糖、肝脏脂肪变性、肝脏炎症反应、肝脏纤维化、肝脏肿瘤、心血管损伤等特征，可用于非酒精性脂肪性肝炎等代谢性疾病药物研发的临床前研究。本发明专利技术动物模型的构建方法简单易行，能广泛推广。该模型能够更好的模拟人类NASH的发病特征、病变进程和各阶段的病变特征，并能体现NASH患者心血管疾病共存的特征，因此对NASH等代谢性疾病药物研发的临床前研究提供了重要工具。床前研究提供了重要工具。床前研究提供了重要工具。

【技术实现步骤摘要】
一种基于PEDF/LDLR双基因敲除的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型构建方法及应用


[0001]本专利技术属于医药
，尤其涉及一种基于PEDF/LDLR双基因敲除的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型构建方法及应用。

技术介绍

[0002]非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种无过量饮酒史，以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征，目前已成为全球慢性肝病的主要病因。其病理变化随病程的进展而表现有单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化，并最终发展成肝硬化和肝细胞癌。NASH是非酒精性脂肪肝的一种极端发展形式，定义为伴随有炎症及肝细胞损伤的脂肪变性现象的出现，其特征在于肝脏脂肪变性、炎症、肝细胞损伤和不同程度的纤维化。据统计，目前，NAFLD的全球患病率约为25％，且以每年360万新增病例的速度在急剧增加。其中，约有20％的NAFLD患者进展为NASH，20％的NASH患者进展为肝硬化。因此，NAFLD及NASH发病率的急剧增加已成为全球性的重大公共卫生问题。
[0003]NASH病理机制复杂，代谢异常驱动的炎症反应仍被认是导致NASH发生的关键步骤。然而，尽管关于NASH病理机制研究近年来取得较大进展，但目前尚无经美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准上市的用于临床治疗NASH的药物，导致NASH患者仍面临“无药可治”的局面。临床前研究中最重要的是通过动物试验测试靶点的合理性和药物的成药性。因此，新药研发成功的关键是选择正确的动物模型。NASH药物临床不断受挫，临床前的动物数据难以转化为临床结果，说明当前的动物模型需要改进。当前的NASH动物模型均不能够同时模拟NASH的发病特征、发病进程及各阶段的病理特征。尤其值得关注的是，当前的NASH动物模型存在一个共性的问题，即炎症反应轻微，难以诱导出严重的肝脏炎症反应。严重的肝脏炎症反应恰恰是NASH区别于单纯性脂肪肝的显著标志，显然，当前的NASH动物模型不利于临床前药物效果的评价。另外，临床有25％
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40％的NASH患者同时伴随心血管疾病，并且心血管疾病已成为NASH患者死亡的主要因素。当前尚缺乏公认的能够反映NASH患者心血管疾病共存特征的NASH模型。因此，建立一种以严重的肝脏炎症反应和心血管疾病共存为显著特征的NASH小鼠模型对于NASH的药物研发具有重要意义。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于PEDF/LDLR双基因敲除的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型构建方法及应用。
[0005]为达上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：
[0006]一种基于PEDF/LDLR双基因敲除的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下构建步骤：
[0007](1)利用PEDF基因敲除小鼠与LDLR基因敲除小鼠进行交配，获得PEDF/LDLR双基因
敲除小鼠；
[0008](2)对PEDF/LDLR双基因敲除小鼠进行高脂饲料诱导，获得非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型。
[0009]进一步的，所述步骤(1)中PEDF敲除小鼠和LDLR敲除小鼠均为C57BL/6J背景。
[0010]进一步的，所述步骤(2)中高脂饲料的营养素质量比组成为：蛋白质26.2％、碳水化合物26.3％、脂肪34.9％。
[0011]本专利技术还提供了上述非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的构建方法在动物模型构建领域的应用。
[0012]本专利技术还提供了上述非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的构建方法构建获得的小鼠模型在筛选或治疗代谢性疾病药物中的应用。
[0013]进一步的，所述代谢性疾病包括肥胖、高血脂、胰岛素抵抗、糖尿病、单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝相关肝纤维化、非酒精性脂肪肝相关肝癌和非酒精性脂肪肝伴随的心血管损伤。
[0014]进一步的，所述应用包括药物靶标的筛选、药物的筛选、药物的药效学评价和药物的安全性评价。
[0015]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0016]本专利技术采用高脂饲料诱导，符合人类NASH发病特征；早期发生肥胖、高血脂、胰岛素抵抗、高血糖、肝脏脂肪变性等单纯性脂肪肝表型，后期发生肝脏炎症反应、肝脏纤维化等NASH表型，并有一定几率发生肝脏肿瘤，同时伴随严重的心血管损伤，尤其是肝脏炎症反应强烈，符合人类NASH病变进程和病变特征。
[0017]本专利技术所述方法简单易行，能广泛推广。由于该模型能够更好的模拟人类NASH的发病特征、病变进程和各阶段的病变特征，因此对于NASH等代谢性疾病药物研发的临床前研究提供具有重要意义。
附图说明
[0018]图1为实施例1中4组动物体重、血脂含量、葡萄糖耐量、胰岛素耐量、血清胰岛素含量及血糖检测结果图。
[0019]图2为实施例2中4组动物肝脏重量、肝体比、肝功酶水平、肝脏脂肪变性、肝脏炎症反应及肝脏纤维化评价结果图。
[0020]图3为实施例3中4组动物肝脏重量、肝体比、肝功酶水平、肝脏脂肪变性、肝脏炎症反应及肝脏纤维化评价结果图。
[0021]图4为实施例4中4组动物肝脏肿瘤发生数量统计及肿瘤的鉴定结果图。
[0022]图5为实施例5中4组动物主动脉内径、主动脉瓣血流峰、降支主动脉血流峰、主动脉斑块面积比例和心肌细胞大小检测结果图。
具体实施方式
[0023]以下实验用动物及饲养：
[0024]PEDF敲除小鼠为C57BL/6J背景，由美国Oklahoma University的马建兴教授课题组构建，并由中山大学中山医学院高国全教授课题组友情赠送。LDLR敲除小鼠为C57BL/6J
背景，引进于美国Jackson实验室。PEDF/LDLR双基因敲除小鼠由PEDF敲除小鼠和LDLR敲除小鼠交配获得。
[0025]本专利技术所用实验动物均在中山大学疾病模式动物中心进行扩繁。本专利技术选用实验动物及分组如下：(1)野生正常组：雄性8周龄野生型C57BL/6J小鼠，常规饲料诱导；(2)野生高脂组：雄性8周龄野生型C57BL/6J小鼠，高脂饲料诱导；(3)LDLR敲除高脂组：雄性8周龄LDLR敲除小鼠，高脂饲料诱导；(4)双敲高脂组：雄性8周龄PEDF/LDLR双基因敲除小鼠，高脂饲料诱导。动物于饲养期间自由饮水摄食，每12小时交替照明，温度18
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21℃，湿度50％
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70％。
[0026]动物血清及组织取材：
[0027]样本收集前，动物禁食不禁水12
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16小时。样本收集时，小鼠称重，腹腔注射1％戊巴比妥钠，80mg/kg，待小鼠麻醉后，摘眼球取血并离心收集血清，随后将小鼠仰卧位固定于解剖板上，75％消毒酒精表面消毒。用手术剪剪开小鼠腹腔至胸腔，暴露内脏组织本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于PEDF/LDLR双基因敲除的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下构建步骤：(1)利用PEDF基因敲除小鼠与LDLR基因敲除小鼠进行交配，获得PEDF/LDLR双基因敲除小鼠；(2)对PEDF/LDLR双基因敲除小鼠进行高脂饲料诱导，获得非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型。2.根据权利要求1所述的基于PEDF/LDLR双基因敲除的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中PEDF敲除小鼠和LDLR敲除小鼠均为C57BL/6J背景。3.根据权利要求1所述的基于PEDF/LDLR双基因敲除的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中高脂饲料的营养素质量比组成为：蛋白质26.2％、碳水化合物26.3％、脂肪34.9％。4.如权利要求1<...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡卫斌，李兴会，吴燕笛，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：