一种人T淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物细胞培养领域，具体公开了一种人T淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用，所述无血清培养基包括基础培养基、无血清添加剂、复合脂类和中药单体活性成分；所述无血清添加剂包括：人血白蛋白、人转铁蛋白、重组人胰岛素；所述中药单体活性成分包括：黄芪黄酮、黄芪多糖、甘草多糖、丹参多糖、灵芝多糖；该培养基适用于在不额外添加血清或自体血浆的条件下，分离、激活和培养人来源的T淋巴细胞，支持T细胞快速增殖和高密度生长，提高细胞活性，维持相对稳定的细胞表型，优化不同细胞亚型的比例，提高T细胞回输的效果。提高T细胞回输的效果。提高T细胞回输的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种人T淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物细胞培养领域，具体公开了一种人T淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]免疫细胞治疗也叫过继免疫疗法，是把病人的免疫细胞从血液里面分离出来，在体外用一些细胞因子激活，经过体外培养，使其数量扩增，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体中，以杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。免疫细胞治疗主要包括：树突状细胞诱导的杀伤细胞（DC
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CIK）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、树突状细胞（DC）、自然杀伤细胞（NK）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、T细胞受体基因修饰的T细胞（TCR
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T）、嵌合抗原受体修饰的T细胞（CAR
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T）等。
[0003]目前，CAR
‑
T细胞疗法是国际最前沿的免疫治疗方法之一，它是从人体血液中提取出T淋巴细胞，然后利用基因工程技术在体外嵌入能让T细胞识别特定肿瘤细胞并杀死肿瘤细胞的基因片段，这种CAR
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T细胞经过大量扩增培养后成为“加强型”免疫T细胞，最后回输到患者体内进行治疗。经历了30年的研发历程，第四代的CAR
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T技术整合了自杀基因编辑、免疫因子改造等各种整合性、精细化调控手段，目前在临床上应用包括治疗血液系统疾病、治疗实体瘤等。
[0004]T淋巴细胞（CD3+淋巴细胞）根据表面分子标志物的不同，又可分为诱导/辅助性T淋巴细胞（CD3+CD4+）、抑制/细胞毒性T淋巴细胞（CD3+CD8+）。CD4+ T细胞可以通过增殖和分泌细胞因子来激活其它类型的产生直接免疫反应的免疫细胞；CD8+ T细胞分泌各种细胞因子参与免疫作用，对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用。早期的CAR
‑
T治疗主要是回输CD8+ T细胞，然而CD8+ T细胞具有很强的细胞毒性的同时却在回输后没有足够的增殖能力，持续作用能力较差。目前普遍同时回输CD4+与CD8+ T细胞，CD4+ T细胞可以提供通过细胞因子和其他信号来维持CD8+ T细胞的增殖和活性。
[0005]在CAR
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T细胞培养过程中，T细胞无血清培养基提供细胞活化和增殖的直接环境，起到非常重要的作用，在维持T细胞生长的同时还需要支持T细胞的快速扩增，同时CD4+和CD8+ T细胞的比例应维持在相对平衡水平。现有的T细胞无血清培养基，虽然可以提供T细胞的基本生长所需营养，但依旧存在效果不佳的问题，如：1. 无法在完全不添加自体血浆的情况下促进T细胞快速增殖，使得在取用血浆的过程中增加免疫治疗药物受到病原体（细菌、真菌、、支原体、病毒）污染的风险；2. 支持高密度生长能力有限，导致培养基需要量大，增加了成本；3. 不考虑培养后T细胞的CD4+和CD8+亚群比例以及不同亚型的细胞质量，导致回输后效果维持时间短等问题。
[0006]因此，研发出一种可以刺激和支持T淋巴细胞快速扩增、高密度生长、细胞表型（CD4+/CD8+亚群比例）相对稳定的无血清培养基是十分必要的。

技术实现思路

[0007]针对上述情况，本专利技术公开了一种人T淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用，本专利技术所述培养基适用于在不额外添加血清或自体血浆的条件下，分离、激活和培养人来源的T淋巴细胞，支持T细胞快速增殖和高密度生长，提高细胞活性，维持相对稳定的细胞表型，优化不同细胞亚型的比例，提高T细胞回输的效果。
[0008]本专利技术的技术方案如下：一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述无血清培养基包括基础培养基、无血清添加剂、复合脂类和中药单体活性成分；进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述无血清添加剂包括：人血白蛋白、人转铁蛋白、重组人胰岛素；进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述中药单体活性成分包括：黄芪黄酮、黄芪多糖、甘草多糖、丹参多糖、灵芝多糖。
[0009]进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，黄芪黄酮的含量为0.5
‑
2mg/L；黄芪多糖的含量为5
‑
15mg/L；甘草多糖的含量为0.5
‑
2mg/L；丹参多糖的含量为3
‑
10mg/L；灵芝多糖的含量为3
‑
10mg/L。
[0010]进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述基础培养基由α
‑
MEM、IMDM、RPMI 1640、DMEM/F
‑
12、F
‑
12K中的两种或三种按一定比例混合而成；优选的，将α
‑
MEM、IMDM和F
‑
12K按照1:1:1的体积比例混合均匀； 或者将RPMI 1640和DMEM/F
‑
12按照1:1的体积比例混合均匀。
[0011]进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述复合脂类包括花生四烯酸、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、棕榈油酸、硬脂酸、乙醇胺。
[0012]进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述的复合脂类包括0.01
‑
0.1mg/L花生四烯酸、0.05
‑
0.5mg/L胆固醇、0.1
‑
0.5mg/L亚油酸、0.1
‑
10mg/L亚麻酸、0.05
‑
0.2mg/L棕榈油酸、0.02
‑
0.2mg/L硬脂酸、0.5
‑
4mg/L乙醇胺。
[0013]进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述无血清添加剂包括人血白蛋白、人转铁蛋白、重组人胰岛素、地塞米松、钼酸钠二水、氯化镍、二氯化锰四水、亚硒酸钠、精胺盐酸盐、R848、L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸三钠盐、三碘甲状腺原氨酸、Pluronic
™ꢀ
F
‑
68。
[0014]进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述的人血白蛋白的含量为2
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5mg/L；人转铁蛋白的含量为0.3
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20mg/L；重组人胰岛素的含量为0.6
‑
30mg/L；地塞米松的含量为0.0001
‑
0.001mg/L；钼酸钠二水的含量为0.2
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0.8mg/L；氯化镍的含量为0.05
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0.2mg/L；二氯化锰四水的含量为0.06
‑
0.2mg/L；亚硒酸钠的含量为5
‑
10mg/L；精胺盐酸盐的含量为0.04
‑
1mg/L；R848的含量为0.1
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1mg/L；L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸三钠盐的含量为0.02
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人T淋巴细胞无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基包括基础培养基、无血清添加剂、复合脂类和中药单体活性成分。2.根据权利要求1所述的一种人T淋巴细胞无血清培养基，其特征在于，所述无血清添加剂包括：人血白蛋白、人转铁蛋白、重组人胰岛素。3.根据权利要求1所述的一种人T淋巴细胞无血清培养基，其特征在于，所述中药单体活性成分包括：黄芪黄酮、黄芪多糖、甘草多糖、丹参多糖、灵芝多糖。4.根据权利要求3所述的一种人T淋巴细胞无血清培养基，其特征在于，黄芪黄酮的含量为0.5
‑
2mg/L；黄芪多糖的含量为5
‑
15mg/L；甘草多糖的含量为0.5
‑
2mg/L；丹参多糖的含量为3
‑
10mg/L；灵芝多糖的含量为3
‑
10mg/L。5.根据权利要求1所述的一种人T淋巴细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基由α
‑
MEM、IMDM、RPMI 1640、DMEM/F
‑
12、F
‑
12K中的两种或三种按一定比例混合而成。6.根据权利要求1所述的一种人T淋巴细胞无血清培养基，其特征在于，所述复合脂类包括花生四烯酸、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、棕榈油酸、硬脂酸、乙醇胺。7.根据权利要求6所述的一种人T淋巴细胞无血清培养基，其特征在于，所述的复合脂类包括0.01
‑
0.1mg/L花生四烯酸、0.05
‑
0.5mg/L胆固醇、0.1
‑
0.5mg/L亚油酸、0.1
‑
10mg/L亚麻酸、0.05
‑
0.2mg/L棕榈油酸、0.02
‑
0.2mg/L硬脂酸、0.5
‑
4mg/L乙醇胺。8.根据权利要求2所述的一种人T淋巴细胞无血清培养基，其特征在于，所述无血清添加剂还包括地塞米松、钼酸钠二水、氯化镍、二氯化锰四水、亚硒酸钠、精胺盐酸盐、R848、L
‑
抗坏血酸
‑2‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：姜梦，李民强，初晓飞，
申请(专利权)人：大连博格林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：