一种血浆外泌体提取试剂、富集方法、提取试剂盒及其应用技术

本发明专利技术公开了一种血浆外泌体提取试剂，具体的公开了一种血浆外泌体提取试剂、富集方法、提取试剂盒及其应用。本发明专利技术公开的技术方案与传统的超高速离心相比，样本中的外泌体所受到的压力较小，可以保持较完整的形态；本方案在传统非离子聚合物PEG的基础上添加了多聚赖氨酸一种带正电荷的氨基酸聚合物、poly

【技术实现步骤摘要】
一种血浆外泌体提取试剂、富集方法、提取试剂盒及其应用


[0001]本专利技术公开了一种血浆外泌体提取试剂，具体的公开了一种血浆外泌体提取试剂、富集方法、提取试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]外泌体，是一种直径约30
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150nm的双层脂膜囊泡状结构的分泌小体。大多数的真核细胞通过分泌作用都可以形成外泌体，细胞通过外泌体可以传递信号分子，包括蛋白质、脂类、以及核酸。在细胞间信号传导中，外泌体还可通过配体
‑
受体识别作用，特异性结合靶细胞。目前外泌体提取方法主要有以下几种：超速离心法、磁珠免疫法、超滤法。
[0003]1.超速离心法是最常使用的外泌体提取方法。主要操作步骤如下：(1)低速离心(300xg)去除细胞；(2)高速离心(16,500xg)去除细胞碎片；(3)过0.22μm滤膜除去体积较大的分泌小体；(4)超速离心(120,000xg)沉淀外泌体。
[0004]超速离心方法的缺点：耗时，整个提取过程至少需要8
‑
24小时；提取效率低，有文献报道，超速离心的外泌体提取效率仅为10％；设备要求高，常规实验室不具备超速离心的条件。
[0005]2.磁珠沉淀法：此方法通过偶联外泌体特异性抗体的磁珠与样本进行孵育，表达相应抗原的外泌体会被磁珠捕获并沉淀下来。外泌体表面有其特异性标记物(如CD63、CD9蛋白)，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。
[0006]磁珠沉淀方法的缺点：费用高，磁珠偶联抗体价格贵，一般仅能针对微量样本，不适用于大体积样本的外泌体提取；提取效率低，由于磁珠标记抗体的特异性，只能提取特异性表达相应抗原的外泌体，限制了该方法提取的效果；
[0007]3.超滤法：超滤膜也可用于分离外泌体。根据外泌体的大小，从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。超滤法的缺点：该方法通常需要结合超速离心，并且由于过滤膜的粘附，可能会损失外泌体，并且过滤时的压力和剪切力，可能会使外泌体变形受损。

技术实现思路

[0008]针对上述情况，本专利技术公开了一种血浆外泌体提取试剂、富集方法、提取试剂盒及其应用。
[0009]本专利技术的技术方案如下：
[0010]一种血浆外泌体提取试剂，所述提取试剂包括非离子多聚物、硫化物、加入或者不加入盐。
[0011]进一步的，上述一种血浆外泌体提取试剂，所述非离子多聚物选自PEG、多聚赖氨酸、多聚赖氨酸PEG、DSS、PVP、硫酸葡聚糖中的一种或者多种；所述硫化物选自TCEP、DTT、巯基乙醇中的一种或者多种；所述盐为氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化锰、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠的一种或多种。
[0012]进一步的，上述一种血浆外泌体提取试剂，所述的PEG分子量为5000
‑
20000道尔顿，具体可以为5000道尔顿、8000道尔顿、10000道尔顿、20000道尔顿；所述PVP的分子量为10000
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40000道尔顿，具体可以为10000道尔顿、25000道尔顿、38000道尔顿；所述的硫酸葡聚糖分子量为3000
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50000道尔顿，具体可以为5000道尔顿、10000道尔顿、25000道尔顿、40000道尔顿；所述多聚赖氨酸的分子量为3万
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30万道尔顿，具体可以为3万
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7万道尔顿、7万
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15万道尔顿、15万
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30万道尔顿；所述多聚赖氨酸PEG为polylysine PEG Conjμgate,分子量为2000或者是polylysine PEG Conjμgate,分子量为5000。
[0013]进一步的，上述一种血浆外泌体提取试剂，所述非离子多聚物在试剂中的最终质量浓度为10
‑
50％。
[0014]进一步的，上述一种血浆外泌体提取试剂，所述硫化物在试剂中的最终浓度范围为0.1
‑
10mg/ml。
[0015]进一步的，上述一种血浆外泌体提取试剂，所述盐在试剂中的最终浓度范围为5mM
‑
500mM。
[0016]进一步的，使用上述血浆外泌体提取试剂富集外泌体的方法，包括以下步骤：
[0017]1)按常规方法获得血浆样本，加入生理盐水或者磷酸盐缓冲溶液处理样本；加入体积为样本体积的0.5
‑
2倍，充分混匀；
[0018]2)向步骤1)所得的生物样品中加入蛋白酶K溶液，加入体积为步骤1)最终体积的0.01
‑
0.1倍，充分混匀后30
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40℃处理；然后加入血浆外泌体提取试剂，加入体积为上述总体积的0.1
‑
2倍。
[0019]3)将步骤2)所得的溶液混合均匀，放置2
‑
8℃环境下静置1
‑
60分钟。
[0020]4)将步骤3)所得的溶液将样品于低速下离心5000
‑
10000g，离心时间为5
‑
30分钟，所得沉淀为外泌体。
[0021]优选的，所述常规方法为：
[0022]1)将血液样品进行预处理，采集血液进行抗凝处理，室温静置1h或者2
‑
8℃静置过夜；
[0023]4℃，3000xg离心5
‑
10分钟，上层的透明黄色液体即为血浆，小心转移上清至新的离心管中；
[0024]4℃，10000xg离心20分钟，去除残留碎片；将上清转移到新的离心管中，注意不要吸到底部的沉淀；
[0025]加入生理盐水或者磷酸盐缓冲溶液处理处理样本；加入体积为样本体积的0.5
‑
2倍，充分混匀。
[0026]一种血浆外泌体提取试剂盒，包括上述血浆外泌体提取试剂。
[0027]进一步的，上述血浆外泌体提取试剂盒，还包含有蛋白酶K。
[0028]进一步的，上述血浆外泌体提取试剂在提取小鼠或者大鼠血浆外泌体中的应用。
[0029]与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：
[0030]本专利技术公开的技术方案与传统的超高速离心相比，样本中的外泌体所受到的压力较小，可以保持较完整的形态；本方案在传统非离子聚合物PEG的基础上添加了多聚赖氨酸一种带正电荷的氨基酸聚合物、poly
‑
lysine PEG Conjμgate、以及硫化物TCEP或者DTT，使得提取过程所需要的时间更短、所需要的样本起始量更低、提取效率更高，提取成本低。通
过本方案获得的血浆外泌体可适用于多种下游实验，如RNA分析、高通量测序、细胞共培养等。
附图说明
[0031]图1为实施案例1中western blot验证结果；
[0032]图2为实施案例1中粒径分布图；
[0033]图3为实施案例1中NTA电影图片；
[0034]图4为实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血浆外泌体提取试剂，其特征在于，所述提取试剂包括非离子多聚物、硫化物、加入或者不加入盐。2.根据权利要求1所述的一种血浆外泌体提取试剂，其特征在于，所述非离子多聚物选自PEG、多聚赖氨酸、多聚赖氨酸PEG、DSS、PVP、硫酸葡聚糖中的一种或者多种；所述硫化物选自TCEP、DTT、巯基乙醇中的一种或者多种；所述盐为氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化锰、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠的一种或多种。3.根据权利要求2所述的一种血浆外泌体提取试剂，其特征在于，所述的PEG分子量为5000
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20000道尔顿；所述PVP的分子量为10000
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40000道尔顿；所述硫酸葡聚糖分子量为3000
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50000道尔顿；所述多聚赖氨酸的分子量为3万
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30万道尔顿；所述多聚赖氨酸PEG为polylysine PEG Conjμgate, 分子量为2000
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5000道尔顿。4.根据权利要求2所述的一种血浆外泌体提取试剂，其特征在于，所述非离子多聚物在试剂中的最终质量浓度为10
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50%。5.根据权利要求2所述的一种血浆外泌体提取试剂，其特征在于，所述硫化物在试剂中的最终浓度范围为0.1
‑
10mg/ml。6.根据权利要求2所述的一种血浆外泌体提取试剂，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩俊东，李民强，周丽丽，
申请(专利权)人：大连博格林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：