一种链霉亲和素及其纯化方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，公开了一种链霉亲和素及其纯化方法

【技术实现步骤摘要】
一种链霉亲和素及其纯化方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种链霉亲和素及其纯化方法
。

技术介绍

[0002]链霉亲和素
(Streptavidin
，简称
SA)
是与亲和素有相似生物学特性的一种蛋白质，链霉亲和素具有与生物素特异性结合的能力，并能与过氧化物酶
、
碱性磷酸酶
、
荧光基团等结合，在
WB、IHC、ISH、
流式细胞术
、
化学发光领域发挥着巨大的作用
。
[0003]链霉亲和素是由四个分子量
16kD
的亚基构成的四聚体蛋白，分子量约为
64kDa
，等电点
6.0
，一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合，其与生物素的解离常数接近
10
15
M
，是一种非常完美的生物素结合蛋白，同时对生物素类似小分子也有广泛的结合能力
。
[0004]链霉亲和素是由多个
β
折叠形成的桶装结构，其结合生物素位点位于桶装结构开口处
。
链霉亲和素与生物素通过氢键及疏水作用广泛结合
。
其中
79、92、108
的
Trp(Slate)
对链霉亲和素疏水结合起到关键作用
。23
位的
Asn、27
位的
Ser、43
位的
Tyr、45
位的
Ser、128
位的
Asp
对结合生物素的氢键结合贡献巨大
。
[0005]链霉亲和素虽然在结合生物素方面表现优异，但链霉亲和素目前的纯化工艺相对繁琐，同时产量较低
。
工业上目前常采用变复性的方式纯化蛋白，纯化周期及纯化材料消耗较大
。
找到一种同生物素结合能力相近，纯化步骤简单高效的链霉亲和素对生物学领域具有重要的意义
。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种链霉亲和素
、
制备及其纯化方法
。
[0007]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种链霉亲和素，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。
[0008]本专利技术的进一步优选，上述链霉亲和素氨基酸序列密码子优化：以大肠杆菌作为表达菌株，通过
sequence manipulation suite(Version2)
优化
。
优化后核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0009]本专利技术的进一步优选，上述链霉亲和素表达载体为
pET28a。
[0010]本专利技术的进一步优选，上述链霉亲和素表达菌株为
BL21
或
DE3。
[0011]上述链霉亲和素的制备及纯化方法，包括如下步骤：
[0012]1.
人工基因合成及定点突变引入：依据链霉亲和素氨基酸序列进行改造，将所述链霉亲和素氨基酸序列第
17
位的
Vla
突变为
Asn
，第
45
位的
Ala
突变为
Tyr
，第
47
位的
Gly
突变为
Ser
，第
75
位的
Tyr
突变为
Trp
，第
99
位的
Ala
突变为
Trp
，所得氨基酸序列即如
SEQ ID NO.1
所示；
[0013]2.
将在步骤1突变后的氨基酸序列的
N
端添加
Met
以
ATG
作为起始密码子，将步骤1所述氨基酸序列
(SEQ ID NO.1)
进行密码子优化，并在其后的3’‑
端添加终止密码子
TAA
；
[0014]3.
将步骤2中得到的序列在华大基因进行合成，得到人工
DNA
序列，将该序列导入
pET28a
表达载体中，使用
BL21(DE3)
菌株进行表达；
[0015]4.
将步骤3所述表达后的转化细胞进行摇瓶培养，温度
37℃
，
200rpm
过夜培养，按照体积比为1％的比例将培养的菌液接种到新鲜的含
100
μ
g/ml
卡那霉素的
LB
液体培养基中，
37℃、200rpm
条件下振荡培养至菌液浓度
OD600
在
0.8
～
1.2
，加入诱导物
IPTG
至工作浓度
1mM
继续培养
24
小时，
4℃、8000rpm
条件下离心
10min
而后收集菌体；离心获得发酵菌体采用
SDS
‑
PAGE
进行表达量测定，选取表达量最高的菌株，进行发酵培养，培养条件
37℃、200rpm
；离心
(8000rpm
，
10min)
获得菌体，之后使用缓冲液
PBS
进行清洗离心，重复3次
。
留取菌体在冰上进行超声破碎，破碎
buffer
为
20mM Tris pH 7.0
；功率
200W
，超声
5s
，间隔
5s
，持续
10min
，然后进行离心，留取上清；
[0016]5.
将步骤4获得的上清进行阴离子交换纯化，使用阴离子交换的填料为千纯生物科技有限公司的
Rigose Q(1L)
，使用低盐
buffer 20mM Tris pH 7.0
进行上样，以
5ml/min
的流速进行纯化，收集穿出液
(Flow
‑
through)
中的蛋白；该步可使制备出的链霉亲和素
JC2
纯度达到
90
％以上；随后将收集到的流穿用
5kD
的膜包进行浓缩，将样品蛋白体积控制到分子筛柱体积的
10
％以内；随后使用千纯生物科技有限公司的分子筛
PG75(1L)
进行精纯脱盐操作，使用
PBS pH 7.0
上样，以
1ml/min
的流速对样品进行杂蛋白分离及置换
buffer
；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种链霉亲和素，其特征在于，氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。2.
根据权利要求1所述的链霉亲和素，其特征在于，所述链霉亲和素氨基酸序列密码子优化，优化后核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。3.
根据权利要求2所述的链霉亲和素，其特征在于，所述优化方法为：以大肠杆菌作为表达菌株，通过
Version2
版本的
sequence manipulation suite
优化
。4.
根据权利要求2所述的链霉亲和素，其特征在于，所述链霉亲和素表达载体为
pET28a。5.
根据权利要求2所述的链霉亲和素，其特征在于，所述链霉亲和素表达菌株为
BL21
或
DE3。6.
如权利要求1所述的链霉亲和素，其特征在于，步骤包括：
a.
人工基因合成及定点突变引入：依据链霉亲和素氨基酸序列进行改造，将所述链霉亲和素氨基酸序列第
17
位的
Vla
突变为
Asn
，第
45
位的
Ala
突变为
Tyr
，第
47
位的
Gly
突变为
Ser
，第
75
位的
Tyr
突变为
Trp
，第
99
位的
Ala
突变为
Trp
，所得氨基酸序列即如
SEQ ID NO.1
所示；
b.
将在步骤
a
突变后的氨基酸序列的
N
端添加
Met
以
ATG
作为起始密码子，将步骤1所述氨基酸序列
SEQ ID NO.1
进行密码子优化，并在其后的3’‑
端添加终止密码子
TAA
；
c.
将步骤
b
中得到的序列在华大基因进行合成，得到人工
DNA
序列，将该序列导入
pET28a
表达载体中，使用
BL21
或
DE3
菌株进行表达；
d.
将步骤
c
所述表达后的转化细胞进行摇瓶培养，温度
37℃
，
200rpm
过夜培养，按照...

【专利技术属性】
技术研发人员：丛建铭，李民强，岳敏，
申请(专利权)人：大连博格林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：