一种重组链霉亲和素、其编码基因、重组质粒和基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组链霉亲和素、其编码基因、重组质粒和基因工程菌及其应用，该重组链霉亲和素的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.5所示。该重组链霉亲和素通过序列改造，增加一段多肽后，通过基因重组技术在大肠杆菌中成功获得表达，该链霉亲和素的特异性好，效价高，将该重组链霉亲和素作为放大系统应用到胶体金抗原检测试剂盒中，具有特异性高、灵敏性高、稳定性好的优点，满足胶体金层析检测试剂盒的要求，可作为放大系统应用到层析检测试剂中。放大系统应用到层析检测试剂中。放大系统应用到层析检测试剂中。

【技术实现步骤摘要】
一种重组链霉亲和素、其编码基因、重组质粒和基因工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及基因重组以及免疫诊断
，尤其涉及一种重组链霉亲和素、其编码基因、重组质粒和基因工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]70年代以来，随着免疫化学技术的发展，各种生物素标记技术被逐渐建立起来，生物素
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亲和素系统被作为放大系统开始应用于免疫学各个领域。随后，与亲和素(AV)有相似生物学特性的链霉亲和素(SA)被发现，并且，生物素
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链霉亲和素在被用于检测抗原
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抗体系统时，其非特异性结合远比用生物素
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亲和素低，且灵敏度更高，因此，生物素
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链霉亲和素放大系统在免疫学各领域应用越来越广泛。
[0003]链霉亲和素(strepavidin，SA)是链霉亲和素菌(Streptmyces avidinii)分泌的一种蛋白质，与生物素(biotin)有高度特异性的亲和力。链霉亲和素为四聚体，平均每个亚基都能结合一分子生物素，Streptavidin
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Biotin之间亲和力非常强。天然SA在分泌过程中去掉N端24AA信号肽，单体由169个氨基酸组成，分子量为16.5kDa，四聚体分子量为66.0kDa。但分离纯化的SA分子量约为60kDa，每个单链分子量约为15kDa。经研究表明全长蛋白在链霉亲和素菌外分泌发酵过程中易被细胞外分泌的蛋白酶酶切，将N端10
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12个氨基酸残基，C端去掉19
‑r/>21个氨基酸切除，成为不完整的SA，因此分离纯化的SA会比全长蛋白短；研究表明，SA氨基酸两端的序列为疏水性序列，该疏水序列会降低蛋白溶解性，同时研究证实SA两端序列也不利于SA与生物素结合，SA在分泌过程中，蛋白酶切除这两段序列，恢复了SA的溶解性，大大降低了在细胞内由于过多结合生物素照成的细胞毒性，起到保护细胞的作用。截短的SA，被称为核心链霉亲和素(Core Streptavidin，CSA)其具有溶解性好，生物活性、稳定性、耐酸、耐尿素及盐酸胍能力高的特点，是当前国内为主要使用的链霉亲和素形式。
[0004]目前，链霉亲和素在包被于微球、酶联免疫用96孔板、标记各种酶、荧光素等均具有广泛应用，但胶体金层析检测试剂上，多数厂家的SA产品稳定性不佳，应用时容易出现条带粗、晕染，显色浅、特异性差等问题，因此，开发出更适用在胶体金平台应用的高效重组链霉亲和素具有重要意义。
[0005]因此，现有技术有待进一步改进。

技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利技术提供了一种新的重组链霉亲和素、其编码基因、重组质粒和基因工程菌，还提供了该重组链霉亲和素的制备方法及应用，该改进后的重组链霉亲和素的活性和稳定性得到显著提高，适用于胶体金层析检测试剂应用领域。
[0007]本专利技术提供的技术方案具体如下：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种重组链霉亲和素，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
该重组链霉亲和素(命名为rSA(Recombinant Streptavidin))序列如下：MAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGHYESAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASGGGSAEAAACDKTSSSHTCPKYLKKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPPK
[0009]上述序列中，部分序列选取如SEQ ID NO.2所示的链霉亲和素核心区域的第13
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139的氨基酸序列，并且将序列中第59
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61位氨基酸的RYD突变为HYE，由于该RYD序列能与带纤维结合素受体的细胞结合，进行该突变后，可有效避免该蛋白与组织细胞进行非特异性结合。
[0010]SEQ ID NO.2的序列为：
[0011]AEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS
[0012]其次，在该链霉亲和素核心区域的羧基端通过一段连接肽(序列为GGGS，如SEQ ID NO.4所示)与一多肽片段(序列如SEQ ID NO.3所示)进行连接。该多肽片段有助于提高链霉亲和素的复性率，提高重组链霉亲和素在层析检测中的效价。
[0013]SEQ ID NO.3的序列为：
[0014]AEAAACDKTSSSHTCPKYLKKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPPK
[0015]相对于现有的核心链霉亲和素(CSA)，进行上述序列改进后得到的重组链霉亲和素rSA，其效价更高，稳定性和特异性都得到显著提高，在胶体金检测试纸条中应用时，条带显色清晰，无晕染，其灵敏度达到5pg/ml，远高于对照组的CSA。特异性检测实验中，本申请的重组链霉亲和素rSA的特异性高，结果准确性高，在应用中无需添加阻断剂，节省成本，而对照组出现假阳性，需要额外添加阻断剂可消除。
[0016]第二方面，本专利技术提供一种重组链霉亲和素，其序列在前述氨基酸序列的羧基端携带载体上氨基酸LE及His标签：HHHHHH。
[0017]通过添加该His标签，使所述重组链霉亲和素菌便于通过金属螯合层析(IMAC)进行纯化，提高该蛋白的纯化效率，且不影响蛋白的活性。
[0018]因此，其他实施例中，若重组链霉亲和素不采用金属螯合层析进行纯化，上述His标签可省去。
[0019]第三方面，本专利技术还提供所述的重组链霉亲和素的编码基因。可根据前述提供的重组链霉亲和素的氨基酸序列得到其编码基因。并根据其应用的表达系统的密码子偏爱性得到编码基因。因此，本专利技术要保护的重组链霉亲和素的编码基因并不局限于如SEQ ID NO.5所示的基因序列。
[0020]优选地，本专利技术提供一种所述重组链霉亲和素的编码基因，其序列如SEQ ID NO.5所示。该序列是基于大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化后的优选序列，其在大肠杆菌表达体系中产量高，活性高且稳定好。
[0021]第四方面，本专利技术提供一种重组载体，该重组表达载体由表达载体和前述的重组链霉亲和素的编码基因重组而成。
[0022]所述表达载体为pET系列表达载体，如pET
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28ap、pET
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24a或者pET
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32a质粒等。
[0023]第五方面，本专利技术还提供一种重组工程菌，所述重组工程菌是向宿主菌中转化前述的重组表达载体而成。
[0024]优选地，所述宿主菌为大肠杆菌，如可采用大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Rosseta或者其他大肠杆菌突变表达菌株本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组链霉亲和素，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种重组链霉亲和素，其特征在于，其为在如权利要求1所述的氨基酸序列的羧基端添加LE及His标签：HHHHHH。3.如权利要求1所述的重组链霉亲和素的编码基因，其特征在于，序列如SEQ ID NO.5所示。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体由表达载体和如权利要求1或2所述的重组链霉亲和素的编码基因或如权利要求3所述的编码基因重组而成。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET系列表达载体。6.一种重组工程菌，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李林，杨帆，唐大伟，张百灵，张纯瑶，刘万建，刘爱骅，
申请(专利权)人：青岛汉唐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：