本发明专利技术提供了一种核心链霉亲和素及其制备方法及应用，所述核心链霉亲和素的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，和/或核心链霉亲和素可通过先利用重组细菌表达链霉亲和素，然后利用固定酶化技术对链霉亲和素进行酶切得到。本发明专利技术的核心链霉亲和素与生物素结合时具有较高的活性且活性稳定性好，核心链霉亲和素的制备方法简单且制备得到的核心链霉亲和素中CSA纯度高。本发明专利技术的核心链霉亲和素及其制备方法可以在酶联免疫吸附实验、免疫组织化学、时间分辨免疫荧光技术、化学发光、定量PCR、单链DNA制备、生物分子纯化、单克隆抗体制备中应用；尤其是在制备丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒中应用。是在制备丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒中应用。是在制备丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒中应用。
【技术实现步骤摘要】
一种核心链霉亲和素及其制备方法及应用
[0001]本专利技术属于医药生物
，具体是一种核心链霉亲和素及其制备方法及应用。
技术介绍
[0002]链霉亲和素(Streptavidin，下称SA)是一种来自链霉菌(Streptomyces avidinii)分泌的约80kDa的同源四聚体。链霉亲和素是自然界中已知的最稳定的蛋白质之一，它能在高温、极端的pH、变性剂、酶降解等存在的条件下，仍然保持生物活性。链霉亲和素因为其独特的性质，可以与生物素特异性结合，从而形成生物素－链霉亲和素系统。该系统的解离常数Kd为10
‑
15
mol/L，是目前已知的最强的非共价键结合力，这已经远远超过了抗原抗体结合能力(10
‑5～10
‑
11
mol/L)，并至少是其1万倍以上。该系统的特异性强，应用非常广泛，这是因为生物素特别容易和活性生物大分子结合，通过链霉亲和素与生物素的特异性结合，有信号放大的功能，而且不影响生物大分子的活性，在生物科学领域中的运用尤其广泛。因此，获得高活性、高纯度的SA是其发挥重要用途的前提条件。
[0003]链霉亲和素全长编码区183个氨基酸(aa)，包含24aa的信号肽，成熟分子159aa；完整的链霉亲和素溶解性差、易于聚集。早期研究人员获得的自然SA蛋白都比全长短，如：1963年Stapley EO等首次发现SA，当时分离纯化获得的SA分子量约为60kDa，每个单链分子量约为15kDa；80年代研究人员发现天然SA单体肽链由169个氨基酸组成，单链分子量为16.5kDa，四聚体分子量为66.0kDa。经研究证实是因为全长的蛋白在Streptomyces avidinii菌外分泌发酵过程中易被细胞外分泌的蛋白酶酶切，成为不完整的SA蛋白。这种不完整的SA为全长的蛋白去掉两端部分氨基酸片段后形成的，后期研究表明SA氨基酸两端的序列为疏水性序列，是降低全长蛋白溶解性的关键，它的存在也会减弱SA与生物素的亲和能力。当蛋白被分泌到菌体外时，由蛋白酶切去除这两段序列，恢复SA的溶解性，这样可以大大降低它在细胞内由于过多结合生物素造成的细胞毒性，起到保护细胞的作用。核心链霉亲和素(Core Streptavidin，CSA)是链霉亲和素发挥生物活性的核心区段，CSA具有溶解性好，生物活性、稳定性、耐酸、耐尿素及盐酸胍能力高的特点，是当前国内为主要使用的链霉亲和素形式。
[0004]鉴于对CSA的认识，研究技术人员也提出了一些利用宿主细胞表达CSA的方法，如：1998年Anna Gallizia等运用表达载体pET11a和大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)成功地表达了带有T7标签的CSA蛋白，其表达量为70mg/L。2005年Xipeng Liu等运用表达载体pET28a和表达宿主BL21(DE3)分别表达了带有信号肽的SA和CSA，表达量都约在80mg/L左右。然而，研究表明，直接在宿主细胞中表达CSA产量低，且直接利用大肠杆菌原核表达重组核心链霉亲和素，由于其同为菌源性蛋白其表达速度快无法正确折叠而多为包涵体表达，复性后其生物素结合活性相对较弱。为了克服直接表达CSA所存在的问题，近年有研究人员试图在大肠杆菌中实现外分泌表达SA，如：2008年GerhardMiksch等人运用phoA基因的引导序列、相应的强启动子及kil基因构建了一个特殊的表达载体，实现了SA在大肠杆菌BL21(DE3)中大量
的外分泌表达，通过表达条件的优化获得外分泌SA的产量为1715nM(109.76mg/L)。通过直接表达SA的方法有效解决了CSA产量低的问题，然而要获得CSA还得对SA进行酶切处理，在现有技术中主要是通过蛋白酶对SA进行酶切处理得到CSA，然而，在使用蛋白酶酶切时又会存在以下问题：
①
蛋白酶稳定性强，蛋白酶去除不彻底会影响CSA的蛋白稳定性；
②
酶切下的多肽片段或标签区未完全去除会影响CSA的单位质量生物素结合活性。
[0005]综上，目前急需开发一种能以低廉的成本高效地生产出活性较高的链霉亲和素的方法。
技术实现思路
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种核心链霉亲和素及其制备方法及应用，该核心链霉亲和素与生物素结合时具有较高的活性且活性稳定性好，核心链霉亲和素的制备方法简单且制备得到的核心链霉亲和素中CSA纯度高。
[0007]本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种核心链霉亲和素，所述核心链霉亲和素的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]SEQ ID NO:1的序列如下：
[0010]AEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAA。
[0011]在本专利技术的一些实施例中，所述核心链霉亲和素是通过先利用重组细菌表达链霉亲和素，然后利用固定酶化技术对链霉亲和素进行酶切得到的。
[0012]在本专利技术的一些实施例中，所述利用重组细菌表达链霉亲和素包括运用基因工程技术将链霉亲和素氨基酸序列构建至pET28a表达载体中，然后将表达载体转化到肠埃希氏菌(E.coli)的感受态细胞Rosseta中，对细胞进行培养，收集重组菌体，并从重组菌体中分离出链霉亲和素。
[0013]在本专利技术的一些实施例中，构建至pET28a表达载体中的链霉亲和素氨基酸序列含有SEQ ID NO:1的序列中的氨基酸序列；优选地，链霉亲和素氨基酸序列选自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5中的任意一种或两种以上。更优选地，链霉亲和素氨基酸序列选自SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4中的任意一种或两种。最优选地，链霉亲和素氨基酸序列选自SEQ ID NO:3。
[0014]SEQ ID NO:2的序列如下(135aa的链霉亲和素氨基酸序列)：
[0015]DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKP。
[0016]SEQ ID NO:3的序列如下(138aa的链霉亲和素氨基酸序列)：
[0017]DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAA。
[0018]SEQ ID NO:本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种核心链霉亲和素，其特征在于，所述核心链霉亲和素的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的核心链霉亲和素，其特征在于，所述核心链霉亲和素是通过先利用重组细菌表达链霉亲和素，然后利用固定酶化技术对链霉亲和素进行酶切得到的。3.根据权利要求2所述的核心链霉亲和素，其特征在于，所述利用重组细菌表达链霉亲和素包括运用基因工程技术将链霉亲和素氨基酸序列构建至pET28a表达载体中，然后将表达载体转化到肠埃希氏菌的感受态细胞Rosseta中，对细胞进行培养，收集重组菌体，并从重组菌体中分离出链霉亲和素；优选地，构建至pET28a表达载体中的链霉亲和素氨基酸序列含有SEQ ID NO:1的序列中的氨基酸序列；更优选地，链霉亲和素氨基酸序列选自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ IDNO:4，SEQ ID NO:5中的任意一种或两种以上。4.根据权利要求2或3所述的核心链霉亲和素，其特征在于，所述利用固定酶化技术对链霉亲和素进行酶切包括将蛋白酶与填料进行偶联形成蛋白酶偶联物后与链霉亲和素在16～25℃下进行酶切反应，然后移除蛋白酶偶联物；优选地：所述蛋白酶选自蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、纤溶酶中一种以上；更优选地，所述蛋白酶带有组氨酸标签；进一步优选地，所述蛋白酶与填料的用量比为每1mL填料加蛋白酶5～10mg；和/或，所述填料为溴化氢活化和/或NHS活化琼脂糖基质。5.一种核心链霉亲和素的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：(1)利用重组细菌表达链霉亲和素；(2)利用固定酶化技术对链霉亲和素进行酶切。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括运用基因工程技术将链霉亲和素氨基酸序列构建至pET28a表达载体中，然后将表达载体转化到肠埃希氏菌的感受态细胞Rosseta中，对细胞进行培养，收集重组菌体，并从重组菌体中分离出链霉亲和素；优选地：构建至pET28a表达载体中的链霉亲和素氨基酸序列含有SEQ ID NO:1的序列中的氨基酸序列；更优选地，构建至pET28a表达载体中的链霉亲和素氨基酸序列选自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5中的任意一种或两种以上；和/或，所述对细胞进行培养包括：培养到OD
600
＝0.6～1.2时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM后，在36～38℃下诱导4～6h；更优选地，所述核心链霉亲和素包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的核心链霉亲和素。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)还包括将收集到的...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩新鹏，何涛，刘枫，冯俊淳，
申请(专利权)人：四川安可瑞新材料技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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