基因修饰的NK细胞及其用途制造技术

本文公开了经基因修饰以包含编码C

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因修饰的NK细胞及其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年8月8日提交的新加坡申请号10201907378Q的优先权，其内容通过引用整体并入本文以用于所有目的。


[0003]本专利技术一般涉及生物技术和细胞疗法领域。具体而言，本专利技术涉及用于癌症免疫疗法的基因修饰的NK细胞、其制备方法和在有需要的患者中的用途。

技术介绍

[0004]近年来，在利用免疫效应细胞进行癌症治疗方面取得了巨大进展。使用表达嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化的T淋巴细胞的癌症免疫疗法是治疗一些血液癌症的有效方法。CAR由细胞外抗原结合结构域(通常是来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv))和细胞内信号传导结构域组成。尽管最近在临床试验中取得了成功，但CAR修饰的T细胞仍然存在一些主要的限制。此外，为每位个体患者生产自体CAR
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T细胞产品的需求在后勤上是苛刻的，并且对于在医疗实践中更广泛地采用具有限制性。其次，制造患者特异性的CAR
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T细胞通常需要数周，这对于治疗患有晚期疾病的患者来说是重大缺陷。此外，并非总是可以从经过大量预治疗的患者中收集足够的淋巴细胞来产生足够数量的CAR
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T细胞。同种异体的“现货”产品可以克服这些挑战，但同种异体T细胞会带来移植物抗宿主病(GVHD)的重大风险。
[0005]自然杀伤细胞(NK细胞)是一种淋巴细胞，它是先天免疫系统的一部分。NK细胞在癌症免疫监视中发挥着重要作用。与T细胞相比，它们不需要预先敏化和识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子以复合物存在的肽抗原。相反，NK细胞的细胞毒性可以通过一系列天然受体的适当刺激而迅速触发，原则上这可以降低由CAR靶向抗原丢失而介导的复发或耐受性的风险。重要的是，在临床上转移同种异体NK细胞后的良好安全性且没有明显毒性(缺乏引起GVHD的可能性)被认为是相对于T细胞疗法的重要的实际优势。因此，使用自然杀伤(NK)细胞的过继细胞转移疗法是癌症患者最有希望的免疫治疗方式之一。然而，迄今为止，该方法的成功仅限于血液病恶性肿瘤患者。此外，由于实体瘤的特殊病理生理学特征，包括靶抗原异质性、CAR免疫细胞运输障碍以及肿瘤微环境的内在负调控机制，NK细胞疗法向非血液病恶性肿瘤的转化具有挑战性。
[0006]因此，本专利技术的目的是提供用于癌症免疫疗法的修饰的NK细胞，其解决了一些或所有上述问题。

技术实现思路

[0007]在一方面，本专利技术公开了一种自然杀伤(NK)细胞，该细胞经基因修饰以包含编码C
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C基序趋化因子受体1(CXCR1)的重组核酸。
[0008]在另一方面，本专利技术公开了一种药物组合物，包含药学有效量的本专利技术的NK细胞和药学上可接受的赋形剂。
[0009]在另一方面，本专利技术公开了一种治疗有需要的受试者的癌症或肿瘤的方法，包括向受试者施用药学有效量的本专利技术的NK细胞或本专利技术的药物组合物。
[0010]在另一方面，本专利技术公开了一种治疗有需要的受试者的癌症或肿瘤的方法，该方法包括：(i)从受试者或与待治疗的受试者不同的供体获得NK细胞；(ii)提供编码CXCR1的重组核酸；(iii)将编码CXCR1的重组核酸转移到NK细胞中，以获得基因修饰的NK细胞；和(iv)向受试者施用药学有效量的从(iii)中获得的NK细胞。
[0011]在另一方面，本专利技术公开了一种治疗有需要的受试者的癌症或肿瘤的方法，该方法包括：(i)从受试者或与待治疗的受试者不同的供体获得NK细胞；(ii)提供编码CXCR1的重组核酸和编码重组嵌合抗原受体(CAR)的重组核酸；(iii)将编码CXCR1的重组核酸和编码重组CAR的重组核酸转移到NK细胞中，以获得基因修饰的NK细胞；和(iv)向受试者施用药学有效量的从(iii)中获得的NK细胞。
[0012]在另一方面，本专利技术公开了一种制备本专利技术的NK细胞的方法，该方法包括：(i)获得或提供NK细胞；(ii)提供编码CXCR1的重组核酸；和(iii)将编码CXCR1的重组核酸转移到NK细胞中。
[0013]在进一步的方面，本专利技术公开了一种制备本专利技术的NK细胞的方法，该方法包括：(i)获得或提供NK细胞；(ii)提供编码CXCR1的重组核酸和编码重组CAR的重组核酸；和(iii)将编码CXCR1的重组核酸和编码重组CAR的重组核酸转移到NK细胞中。
附图说明
[0014]当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本专利技术，其中：
[0015]图1是可用于修饰本公开中描述的NK细胞的构建体的设计概念的示意图(A
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C)。本公开的实施例中描述的特定构建体(D、E)用于产生CXCR1(D)和NKG2D嵌合抗原受体(CAR)(E)的重组mRNA转录物。
[0016]图2是流式细胞术直方图，显示了NK细胞中CXCR1的表达。(A)在大多数新鲜分离的NK细胞中观察到CXCR1表达。(B)如方法部分所述，离体扩增后，NK细胞中的CXCR1表达几乎完全丧失，其表达谱与同型对照几乎相同。(C)用CXCR1 mRNA电穿孔后，大部分离体扩增的NK细胞表达CXCR1，而在没有CXCR1 mRNA的情况下进行电穿孔的离体扩增的NK细胞(“空白(mock)”)几乎不表达或不表达CXCR1。结果表明，在离体扩增的NK细胞中，用编码CXCR1的mRNA对NK细胞进行电穿孔成功恢复并提高了CXCR1的表达。
[0017]图3是显示CXCR1转染的NK细胞向三种不同人类癌细胞迁移的柱状图。本实验评估了用CXCR1 mRNA进行电穿孔的NK细胞向来源于不同卵巢癌细胞系(SKOV3、CaOV3和SW626)的条件培养基的体外迁移，并与不添加任何mRNA进行电穿孔的NK细胞(空白NK细胞)的迁移进行了比较。与空白NK细胞相比，用CXCR1 mRNA进行电穿孔的NK细胞向分泌IL
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8的肿瘤细胞迁移的能力更好。结果表明，CXCR1过表达增加了离体扩增的NK细胞向癌细胞的迁移能力。
[0018]图4显示了过表达CXCR1的NK细胞和空白NK细胞向SKOV3腹腔内异种移植物的细胞迁移研究的结果。通过腹腔注射SKOV3
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luc细胞建立SKOV3异种移植模型。肿瘤接种7天后，使用荧光素对小鼠进行成像以确认腹腔中肿瘤的存在。然后根据相似的肿瘤负荷分配小鼠，然后尾静脉注射DiR标记的NK细胞。(A)显示两组小鼠肿瘤生长的生物发光图像。(B)空
白NK细胞与过表达CXCR1的NK细胞向SKOV3异种移植物的体内迁移。NK细胞注射后，于24和48小时后对小鼠进行成像。(C)NK细胞注射后48小时从腹腔分离肿瘤并进行离体成像。从未经NK细胞处理的小鼠获得的肿瘤用作对照(对照肿瘤)。分离肿瘤的通量值显示在右侧。****：P<0.0001，过表达CXCR1的NK细胞和空白NK细胞之间的统计学显著性。结果表明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种自然杀伤(NK)细胞，所述自然杀伤(NK)细胞经基因修饰以包含编码C
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C基序趋化因子受体1(CXCR1)的重组核酸。2.根据权利要求1所述的NK细胞，其进一步经基因修饰以表达重组嵌合抗原受体(CAR)，所述重组嵌合抗原受体(CAR)包括细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含抗原结合区的细胞外结构域。3.根据权利要求2所述的NK细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包括至少一个含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的结构域。4.根据权利要求2或3所述的NK细胞，其中所述细胞内信号传导结构域是CD3ζ。5.根据权利要求2至4中任一项所述的NK细胞，其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域。6.根据权利要求2至5中任一项所述的NK细胞，其中所述抗原结合区结合肿瘤相关抗原。7.根据权利要求6所述的NK细胞，其中所述肿瘤相关抗原是实体瘤相关抗原。8.根据权利要求2至7中任一项所述的NK细胞，其中所述重组CAR的细胞外结构域包括NK细胞激活受体的细胞外结构域或单克隆抗体的scFv片段。9.根据权利要求2至8中任一项所述的NK细胞，其中所述重组CAR的细胞外结构域包括NKG2D受体的细胞外结构域或抗EPCAM单克隆抗体的scFv片段。10.根据权利要求2至9中任一项所述的NK细胞，其中所述重组CAR进一步包含在抗原结合区和跨膜区之间的铰链区。11.根据权利要求10所述的NK细胞，其中所述铰链区是CD8铰链区。12.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学有效量的权利要求1至11中任一项的NK细胞和药学上可接受的赋形剂。13.一种治疗有需要的受试者的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用药学有效量的权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王树，黄宇阳，
申请(专利权)人：新加坡国立大学，
类型：发明
国别省市：