一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法及其应用技术

本申请公开了一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法及其应用，涉及免疫细胞培养的技术领域，其中，一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，使用CIK细胞培养基进行CIK细胞体外扩增，所述CIK细胞培养基包括基础培养基和添加在基础培养基中的第一组分和第二组分；所述第一组分包括蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇；所述第二组分可诱导PBMC细胞分化为CIK细胞，本申请具有提高CIK细胞体外扩增的细胞增殖效果以及CIK细胞的细胞毒性的效果。效果。

【技术实现步骤摘要】
一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法及其应用


[0001]本申请涉及免疫细胞培养的
，尤其是涉及一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法及其应用。

技术介绍

[0002]肿瘤免疫治疗指的是通过恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法，包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗以及小分子抑制剂等方法。
[0003]其中，细胞过继免疫治疗是肿瘤免疫疗法中的一种，具有疗效好、毒副作用小以及无耐药性问题等优点；其通过体外活化或扩增得到自体或异体免疫效应细胞，接着将免疫效应细胞输注至患者体内，免疫效应细胞在体内特异性识别并杀灭血液及组织中的癌细胞以及突变的细胞；从而达到肿瘤治疗的效果。
[0004]细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞)是由人体外周血单个核细胞(PBMCs)诱导产生的异质细胞群，具有杀瘤效果，是肿瘤过继细胞免疫疗法中首选的细胞。CIK细胞不仅对肿瘤细胞有杀伤作用，而且能够增强患者的免疫功能，增强患者的免疫力。
[0005]治疗用CIK细胞通常来源于患者外周血单个核细胞，但是，外周血中杀伤细胞的数量有限，无法满足治疗过程中对于CIK细胞的大量需求，因此需要对CIK细胞进行体外扩增。
[0006]目前，最常使用CD3单克隆抗体、白细胞介素
‑
1白细胞介素
‑
2以及γ
‑
干扰素等因子对PBMC细胞进行活化、扩增，存在着CIK细胞生长缓慢、增殖效果差以及对于肿瘤细胞的细胞毒性弱等问题。

技术实现思路

[0007]为了提高CIK细胞体外扩增的细胞增殖效果以及CIK细胞的细胞毒性，本申请提供一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法及其应用。
[0008]第一方面，本申请提供的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法采用如下的技术方案：一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，使用CIK细胞培养基进行CIK细胞体外扩增，所述CIK细胞培养基包括基础培养基和添加在基础培养基中的第一组分和第二组分；所述第一组分包括蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇；所述第二组分可诱导PBMC细胞分化为CIK细胞。
[0009]优选的，所述第一组分中各物质在基础培养基中的终浓度为：蒲公英甾醇：1.0
‑
2.5μg/mL；菊苣酸：1.5
‑
4.0μg/mL；五味子醇：0.3
‑
1.5μg/mL。
[0010]通过采用上述技术方案，在进行CIK细胞体外扩增的过程中添加蒲公英甾醇、菊苣
酸以及五味子醇，可提高CIK细胞的增殖能力，进而提高了CIK细胞的体外扩增效果。
[0011]优选的，所述第二组分包括干扰素
‑
γ、鼠抗人CD3单克隆抗体、重组人白细胞介素2、重组人白细胞介素1α以及植物血凝素。
[0012]优选的，所述基础培养基独立地选自1640培养基、GT
‑
T551培养基以及RMPI
‑
1640培养基中的一种。
[0013]优选的，所述CIK细胞培养基还包括添加在基础培养基中的第三组分，所述第三组分还包括人参皂苷以及揽香烯。
[0014]优选的，所述第三组分中各物质在基础培养基中的终浓度为：人参皂苷：5.0
‑
7.5μg/mL；揽香烯：0.3
‑
2.0μg/mL。
[0015]通过采用上述技术方案，经过添加有人参皂苷和榄香烯的基础培养基培养得到的CIK细胞中，CD3
+
CD56
+
细胞亚群在CIK细胞群体中的比例提高，同时也提高了细胞内穿孔素和颗粒酶B的含量，从而提高了CIK细胞对肿瘤细胞的毒性，尤其是对血液恶心肿瘤细胞的毒性。
[0016]优选的，具体包括以下培养步骤：S1、从新鲜的静脉外周血中分离得到PBMC细胞；S2、将得到的PBMC细胞加入含有第一组分的基础培养基中，接着加入干扰素
‑
γ，于37℃、5％CO2的培养环境中进行培养；S3、在培养24h后加入鼠抗人CD3单克隆抗体、重组人白细胞介素2、重组人白细胞介素1α以及植物血凝素。
[0017]优选的，所述步骤S2中，添加完干扰素
‑
γ后，补加添加有人参皂苷和揽香烯的基础培养基。
[0018]优选的，所述步骤S2和S3，保持PBMC细胞的密度为2
‑4×
106个/mL。
[0019]第二方面，本申请还提供了一种如上述任一所述的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方式在造血干细胞恶性克隆性疾病治疗中的应用。
[0020]综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：(1)本申请提供了一种CIK细胞培养基，其在基础培养基中加入第一组分，第一组分包括蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇，使用该CIK细胞培养基对PBMC细胞刺激培养，经过一段时间的培养后，细胞扩增倍数相较于仅使用基础培养基有显著的提高，上述成分可促进CIK细胞的增殖，提高CIK细胞的增殖能力，进而提高了CIK细胞体外扩增效果；(2)本申请提供的CIK细胞培养基中还加入了第三组分，第三组分包括人参皂苷和揽香烯，使用该CIK细胞培养基对PBMC细胞刺激培养，经过一段时间的培养后，CIK细胞中CD3
+
CD56
+
细胞亚群的比例提高，且CIK细胞中表达颗粒酶以及穿孔素的细胞比例提高，说明加入第三组分进行CIK细胞的体外培养可提高CIK细胞的细胞毒性。
具体实施方式
[0021]本申请涉及的试剂或试剂盒及其来源如下：蒲公英甾醇(成都植标化纯生物技术有限公司，货号为PCS0704)；菊苣酸(成都植标化纯生物技术有限公司，货号为PCS0514)；
五味子醇(成都植标化纯生物技术有限公司，货号为PCS0879)；人参皂苷(成都植标化纯生物技术有限公司，货号为PCS2777)；揽香烯(Merck公司，货号为63965
‑
25MG)；干扰素
‑
γ(Merck公司，货号为I17001)；鼠抗人CD3单克隆抗体(欧凯生物公司，货号为K103e6)；重组人白细胞介素2(Merck公司，货号为HIL2
‑
RO)；重组人白细胞介素1α(Merck公司，货号为SRP3084)；植物血凝素(Merck公司，货号为11249738001)。
[0022]以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
[0023]本申请提供了一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，使用CIK细胞培养基进行CIK细胞体外扩增，所述CIK细胞培养基包括基础培养基和添加在基础培养基中的第一组分和第二组分；所述第一组分包括蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇；所述第二组分可诱导PBMC细胞分化为CIK细胞。
[0024]在一个实施例中，所述第一组分中各物质在基础培养基中的终本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，其特征在于，使用CIK细胞培养基进行CIK细胞体外扩增，所述CIK细胞培养基包括基础培养基和添加在基础培养基中的第一组分和第二组分；所述第一组分包括蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇；所述第二组分可诱导PBMC细胞分化为CIK细胞。2.根据权利要求1所述的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，其特征在于，所述第一组分中各物质在基础培养基中的终浓度为：蒲公英甾醇：1.0
‑
2.5μg/mL；菊苣酸：1.5
‑
4.0μg/mL；五味子醇：0.3
‑
1.5μg/mL。3.根据权利要求1所述的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，其特征在于，所述第二组分包括干扰素
‑
γ、鼠抗人CD3单克隆抗体、重组人白细胞介素2、重组人白细胞介素1α以及植物血凝素。4.根据权利要求1所述的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，其特征在于，所述基础培养基独立地选自1640培养基、GT
‑
T551培养基以及RMPI
‑
1640培养基中的一种。5.根据权利要求1所述的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，其特征在于，所述CIK细胞培养基还包括添加在基础培养基中的第三组分，所述第三组分还包...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨桂花，杨海霞，赵进军，
申请(专利权)人：和携科技有限公司，
类型：发明
国别省市：