【技术实现步骤摘要】
本申请涉及细胞生物学的，更具体地说，涉及一种永生化间充质干细胞及其构建方法和应用。
技术介绍
1、evs或外泌体由干细胞产生，含有强效细胞因子、生长因子，可能在介导炎症和增强祖细胞增殖方面具有强大的作用。mscs衍生的evs在治疗心血管、呼吸、肾脏和肝脏疾病和软骨再生方面的益处已得到证实。evs表现出更强的逃避免疫系统降解或清除的能力，而mscs来源的evs(msc-evs)由于具有较好的免疫调节作用，尤其是抑制炎症的作用，已被证明在调节不同疾病的细胞内通路中发挥重要的治疗作用。
2、然而，用于治疗所需的evs的数量通常较高。基于此，在临床应用中使用evs的一大挑战是mscs体外扩增的寿命有限，进而导致其产生的evs数量有限。体外培养过程中，尽管mscs在培养初期具有良好的增殖率，但其细胞增殖能力显著下降，并发生复制性衰老。
技术实现思路
1、本申请提供一种永生化间充质干细胞及其构建方法和应用。
2、针对细胞有限扩增问题的解决方案是通过基因操作使细胞永生化。永生化间充质干细胞在保持其分化能力和表达与非永生化的间充质干细胞相同的标志物的同时，具有较高的增殖率和evs的产量，并能够缓解il-1β抑制的软骨细胞活力。
3、第一方面，本申请提供一种永生化间充质干细胞的构建方法，采用如下的技术方案：
4、将tert基因导入所述间充质干细胞中；用于感染所述间充质干细胞的病毒载体为plent-tert-puro载体；
5、rt-qpcr
6、gapdh的引物包括如seq id no.1和seq id no.2所述的核苷酸序列；
7、tert的引物包括如seq id no.3和seq id no.4所述的核苷酸序列；
8、端粒长度检测所用的引物组包括：端粒引物1、端粒引物2、36b4u和36b4d；
9、所述端粒引物1包括如seq id no.5所述的核苷酸序列；
10、所述端粒引物2包括如seq id no.6所述的核苷酸序列；
11、所述36b4u包括如seq id no.7所述的核苷酸序列；
12、所述36b4d包括如seq id no.8所述的核苷酸序列。
13、可选地，所述永生化间充质干细胞为永生化人脐带间充质干细胞(hucmscs)。
14、可选地，所述永生化基因为htert基因。
15、可选地，所述htert基因的异位表达可以延长和维持永生化间充质干细胞的端粒长度。
16、第二方面，本申请提供一种利用上述制备方法制得的永生化间充质干细胞。
17、可选地，所述永生化间充质干细胞中，cd73、cd90、cd105呈阳性，cd45、cd34、cd19、cd14、hla-dr呈阴性。
18、可选地，所述永生化间充质干细胞产生的细胞外囊泡能够缓解il-1β抑制的软骨细胞活力。
19、第三方面，本申请提供一种利用上述制备方法制得的永生化间充质干细胞在制备用于骨关节炎的药物中的应用。
20、综上所述，本申请具有以下有益效果：
21、本申请的永生化间充质干细胞在保持其分化能力和表达与非永生化的间充质干细胞相同的标志物的同时，具有较高的增殖率和evs的产量，并能够缓解il-1β抑制的软骨细胞活力。
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1.一种永生化间充质干细胞的构建方法，其特征在于，将TERT基因导入所述间充质干细胞中；用于感染所述间充质干细胞的病毒载体为pLent-TERT-Puro载体；
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述永生化间充质干细胞为永生化人脐带间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述永生化基因为hTERT基因。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述hTERT基因的异位表达可以延长和维持永生化间充质干细胞的端粒长度。
5.一种权利要求1-4中任一项所述的构建方法制得的永生化间充质干细胞。
6.根据权利要求5所述的永生化间充质干细胞，其特征在于，所述永生化间充质干细胞中，CD73、CD90、CD105呈阳性，CD45、CD34、CD19、CD14、HLA-DR呈阴性。
7.根据权利要求5所述的永生化间充质干细胞，其特征在于，所述永生化间充质干细胞产生的细胞外囊泡能够缓解IL-1β抑制的软骨细胞活力。
8.一种权利要求5-7中任一项所述的永生化间充质干细胞在制备用
...【技术特征摘要】
1.一种永生化间充质干细胞的构建方法，其特征在于，将tert基因导入所述间充质干细胞中；用于感染所述间充质干细胞的病毒载体为plent-tert-puro载体；
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述永生化间充质干细胞为永生化人脐带间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述永生化基因为htert基因。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述htert基因的异位表达可以延长和维持永生化间充质干细胞的端粒长度。
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