【技术实现步骤摘要】
本申请涉及细胞工程，具体涉及一种sirt6永生化hucmscs及其构建方法、sirt6外囊泡及其提取方法。
技术介绍
1、人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hmscs)是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，具有广阔的临床应用前景。近年来，研究人员发现hmscs在骨关节炎(oa)修复中具有较大的潜力。然而研究过程中发现，在hmscs长期离体培养过程中，容易出现遗传不稳定性、染色体结构变化、细胞增殖能力下降、细胞衰老严重等问题。针对上述问题，研究人员经过多年努力，通过基因操作实现了细胞的永生化。
2、外囊泡(evs)是由hmscs产生的双层脂质膜结构的微小囊泡，作为细胞通信的重要介质，evs能够携带蛋白质、rna和其他生物大分子，参与调节生物体内的多种生理和病理过程。由于evs具有低免疫原性、稳定性高、可以自然穿越生物屏障的特性，其已成为治疗oa等疾病最有吸引力的选择。然而，用于oa疾病等临床治疗所需的evs的数量通常较高，并且现有的evs治疗效果一般。
技术实现思路
1、为了实现hucmscs的永生化，并且增强evs在oa等疾病方面的治疗效率，本申请提供一种sirt6永生化hucmscs及其构建方法、sirt6外囊泡及其提取方法。
2、第一方面，本申请提供一种sirt6永生化hucmscs的构建方法，采用如下的技术方案：
3、一种sirt6永生化hucmscs的构建方法，包括以下步骤：hucmscs的
4、所述永生化hucmscs的构建采用的永生化基因为tert基因，所述sirt6永生化hucmscs的构建采用的基因为sirt6。
5、本申请提供了一种sirt6永生化hucmscs的构建方法，上述构建方法首先通过tert慢病毒载体介导hucmscs进行tert过表达，解决了hucmscs在体外培养过程中端粒逐渐缩短导致细胞衰老和生长停滞问题，从而获得了一种与hucmscs的遗传稳定性与功能特性一致的、近乎无限增殖的永生化hucmscs；然后通过sirt6慢病毒载体介导永生化hucmscs进行sirt6过表达，获得了一种与hucmscs的遗传稳定性与功能特性一致的、近乎无限增殖的、且能够过表达sirt6的sirt6永生化hucmscs。sirt6作为一种脱乙酰酶，在调控衰老、dna修复、代谢稳态及抗炎症过程中能够发挥关键作用，本申请提供的sirt6永生化hucmscs能够过表达sirt6，因此在骨关节炎(oa)的病理生理学中能够通过多种机制发挥保护作用，减缓软骨细胞的老化、促进细胞内抗炎反应以及保护关节软骨免受破坏，利用上述sirt6永生化hucmscs能够提取富含过表达sirt6的sirt6外囊泡，sirt6外囊泡不仅携带有促进组织修复和抗炎症的分子，还具备更高的生物活性和治疗效率，为oa的非细胞治疗策略提供了新的视角。综上，本申请通过两次慢病毒介导的基因修饰方法，成功建立了一种可无限增殖、能够过表达sirt6的sirt6永生化hucmscs，为oa的非细胞治疗策略提供了新的视角。
6、可选地，所述永生化hucmscs的构建方法包括以下步骤：将hucmscs接种至培养板，依次加入tert慢病毒、完全培养基、阳离子聚合物，培养48±2h；然后更换含有嘌呤霉素的完全培养基进行筛选与扩增，获得永生化hucmscs。
7、可选地，所述sirt6永生化hucmscs的构建方法包括以下步骤：将永生化hucmscs接种至培养板，依次加入sirt6慢病毒、完全培养基、阳离子聚合物，培养48±2h；然后更换含有灭瘟素s的完全培养基进行筛选与扩增，传代5代后不再添加抗生素；当细胞生长至汇合度80％以上时，按照1：5比例进行传代培养，获得sirt6永生化hucmscs。
8、可选地，所述hucmscs和永生化hucmscs的接种密度均为3.5×105个/孔；所述完全培养基为αmem完全培养基；所述含有嘌呤霉素的完全培养基中嘌呤霉素的浓度为3-5μg/ml，所述含有灭瘟素s的完全培养基中灭瘟素s的浓度为1.5-2.5μg/ml。
9、可选地，所述永生化hucmscs和sirt6永生化hucmscs的构建步骤中，加入阳离子聚合物的同时补充完全培养基，使得阳离子聚合物的终浓度为5-7μg/ml。
10、可选地，所述tert慢病毒的滴度为(7-9)×108tu/ml，所述tert慢病毒、完全培养基的体积比为1：(20-25)；所述灭瘟素s的滴度为(0.8-1.5)×109tu/ml，所述tert慢病毒、完全培养基的体积比为1：(33-38)。
11、第二方面，本申请提供一种sirt6永生化hucmscs的构建方法获得的sirt6永生化hucmscs。
12、第三方面，本申请提供一种sirt6外囊泡，所述sirt6外囊泡通过对sirt6永生化hucmscs进行提取获得。
13、本申请通过对sirt6永生化hucmscs进行提取，从而获得了富含特定治疗因子的sirt6外囊泡，该sirt6外囊泡不仅携带有促进组织修复和抗炎症的分子，还具备更高的生物活性和治疗效率，为oa的非细胞治疗策略提供了新的视角。
14、第四方面，本申请提供一种sirt6外囊泡的提取方法。
15、一种sirt6外囊泡的提取方法，包括以下步骤：对sirt6永生化hucmscs培养，待融合度达到70％以上，去上清；沉淀用pbs洗涤，并加入αmem完全培养基培养48±2h，取上清液于离心管，经离心，获得sirt6外囊泡。
16、可选地，所述离心步骤具体为：
17、s1.将上清液在4℃、2000×g下离心10±2min，取上清液①；
18、s2.将上清液①在4℃、1000×g下离心30±5min，取上清液②；
19、s3.将上清液②在4℃、110000×g下超速离心70±10min，弃上清液；
20、s4.取沉淀并加入pbs重悬，在4℃、110000×g下超速离心70±10min，取沉淀，获得sirt6外囊泡。
21、本申请提供的sirt6外囊泡的提取方法中，通过离心步骤s1去除培养上清液中的死细胞和大碎片，通过离心步骤s2去除培养上清液中的细胞器和小颗粒，通过离心步骤s3和s4获取培养上清液中sirt6外囊泡。
22、本申请中，术语“hucmscs”表示人脐带间充质干细胞；术语“永生化hucmscs”表示tert过表达的永生化人脐带间充质干细胞；术语“sirt6永生化hucmscs”表示tert与sirt6过表达的永生化人脐带间充质干细胞；术语“sirt6外囊泡”表示sirt6永生化hucmscs提取获得的外囊泡；术语“原代外囊泡”表示原代hucmscs提取获得的外囊泡。
23、综上所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种SIRT6永生化hUCMSCs的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：hUCMSCs的提取与培养、永生化hUCMSCs的构建、SIRT6永生化hUCMSCs的构建；
2.根据权利要求1所述的SIRT6永生化hUCMSCs的构建方法，其特征在于，所述永生化hUCMSCs的构建方法包括以下步骤：将hUCMSCs接种至培养板，依次加入TERT慢病毒、完全培养基、阳离子聚合物，培养48±2h；然后更换含有嘌呤霉素的完全培养基进行筛选与扩增，获得永生化hUCMSCs。
3.根据权利要求1所述的SIRT6永生化hUCMSCs的构建方法，其特征在于，所述SIRT6永生化hUCMSCs的构建方法包括以下步骤：将永生化hUCMSCs接种至培养板，依次加入SIRT6慢病毒、完全培养基、阳离子聚合物，培养48±2h；然后更换含有灭瘟素S的完全培养基进行筛选与扩增，传代5代后不再添加抗生素；当细胞生长至汇合度80% 以上时，按照1：5比例进行传代培养，获得SIRT6永生化hUCMSCs。
4.根据权利要求2或3所述的SIRT6永生化hUCMSCs的构建方法，其特
5.根据权利要求2或3所述的SIRT6永生化hUCMSCs的构建方法，其特征在于，所述永生化hUCMSCs和SIRT6永生化hUCMSCs的构建步骤中，加入阳离子聚合物的同时补充完全培养基，使得阳离子聚合物的终浓度为5-7μg/mL。
6.根据权利要求2或3所述的SIRT6永生化hUCMSCs的构建方法，其特征在于，所述TERT慢病毒的滴度为（7-9）×108TU/mL，所述TERT慢病毒、完全培养基的体积比为1：（20-25）；所述灭瘟素S的滴度为（0.8-1.5）×109TU/mL，所述TERT慢病毒、完全培养基的体积比为1：（33-38）。
7.一种利用权利要求1-6中任一项所述的SIRT6永生化hUCMSCs的构建方法获得的SIRT6永生化hUCMSCs。
8.一种SIRT6外囊泡，其特征在于，对权利要求7所述的SIRT6永生化hUCMSCs进行提取获得。
9.一种如权利要求8所述的SIRT6外囊泡的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的SIRT6外囊泡的提取方法，其特征在于，所述离心步骤具体为：
...【技术特征摘要】
1.一种sirt6永生化hucmscs的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：hucmscs的提取与培养、永生化hucmscs的构建、sirt6永生化hucmscs的构建；
2.根据权利要求1所述的sirt6永生化hucmscs的构建方法，其特征在于，所述永生化hucmscs的构建方法包括以下步骤：将hucmscs接种至培养板，依次加入tert慢病毒、完全培养基、阳离子聚合物，培养48±2h；然后更换含有嘌呤霉素的完全培养基进行筛选与扩增，获得永生化hucmscs。
3.根据权利要求1所述的sirt6永生化hucmscs的构建方法，其特征在于，所述sirt6永生化hucmscs的构建方法包括以下步骤：将永生化hucmscs接种至培养板，依次加入sirt6慢病毒、完全培养基、阳离子聚合物，培养48±2h；然后更换含有灭瘟素s的完全培养基进行筛选与扩增，传代5代后不再添加抗生素；当细胞生长至汇合度80% 以上时，按照1：5比例进行传代培养，获得sirt6永生化hucmscs。
4.根据权利要求2或3所述的sirt6永生化hucmscs的构建方法，其特征在于，所述hucmscs和永生化hucmscs的接种密度均为3.5×105个/孔；所述完全培养基为αmem 完全培养基；所述含有嘌呤霉素的完...
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