低密度细胞培养制造技术

本发明专利技术涉及一种从CD34

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】低密度细胞培养
[0001]本专利技术涉及一种从CD34
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人干细胞产生自然杀伤细胞的集合的方法。本专利技术进一步涉及一种由此产生的自然杀伤细胞的集合和一种包含此类自然杀伤细胞的药物组合物。此外，本专利技术涉及该药物组合物作为药物、特别是用于在用于治疗恶性肿瘤中的免疫疗法的方法中使用的用途。

技术介绍

[0002]造血
[0003]造血干细胞
[0004]多细胞生物体的发育主要依赖于成体干细胞的功能。这些细胞被定义为未分化细胞，这些未分化细胞可以在长时间段内自我更新，并且在发育期间产生定型为更特定谱系的祖细胞。干细胞的受控发育和分化导致高度复杂的功能器官或器官系统。然而，干细胞不受控制的分化或遗传畸变可能导致死亡或者发展癌症、免疫缺陷、自身免疫或骨髓功能不全。在过去50年中，就自我更新能力或谱系特异性分化以及遗传和功能水平上的细胞命运定型而言，HSC已成为研究最深入的干细胞。此外，HSC的移植已被广泛用于治疗白血病和其他类型的癌症(1,2)。已经清楚地证明，成人和新生儿HSC在清髓性治疗后保持重建患者的造血系统的能力(3)。因此，HSC的一个重要特征是能够补充所有谱系的成熟血细胞的能力。
[0005]从HSC至成熟血细胞
[0006]造血描述了HSC的自我更新以及对代表祖细胞和效应细胞的所有不同血液谱系的终生替代的过程和能力。造血在胚胎发育期间发生，并且HSC在妊娠中期中产生在含有背主动脉、性腺和中肾的胚胎区域(即AGM区域)内，并且在卵黄囊、胎盘和胎肝中进一步发育(4)。成人造血位于骨髓(BM)中，并且HSC的自我更新和分化在BM的特定小生境内受到调控(5,6)。在过去30年中，最常见的造血发育模型描述了造血的二元细胞命运树，其中在第一分支中，HSC产生两种不同的造血祖细胞(HPC)，即针对髓样
‑
红细胞的共同髓样祖细胞(CMP)(产生红细胞、血小板、单核细胞、巨噬细胞和粒细胞)和针对淋巴细胞的共同淋巴样祖细胞(CLP)(分化为T细胞、B细胞和NK细胞)(7)。
[0007]造血干细胞移植
[0008]自50多年以来，在用化学疗法和放射疗法进行一线治疗以减轻肿瘤负担并实现长期缓解后，将HSC用于移植以治疗血液癌症和一些实体瘤(8)。由于耐药性和复发仍然是主要问题，因此自体和人白细胞抗原(HLA)相匹配的异基因HSCT被用作恶性和非恶性血液疾病的潜在治愈性细胞疗法治疗。在异基因HSCT中，供体T细胞介导强大的移植物抗肿瘤(GVT)效应(9)。然而，T细胞也可能引起GVHD，并且因此限制了异基因HSCT的整体有效性。T细胞耗尽的各种方法降低了GVHD的风险，并且另外允许跨组织相容性屏障进行移植，但可能增加移植物排斥或复发的风险。最有趣的是，NK细胞已被描述为消除白血病复发和移植物排斥，并且保护患者免于单倍体相合HSCT环境中的GVHD(10)，这主要是因为其抑制和裂解GVHD诱导T细胞(11)和宿主抗原呈递细胞(APC)的能力，这两种细胞对于GVHD诱导中供体T细胞的激活是至关重要的(12)。此外，有临床证据表明，高NK细胞剂量在非亲缘HSCT中预
防严重GVHD，同时保留GvT效应(13)。因此，NK细胞如今已成为非常有吸引力的淋巴细胞群体用于HSCT和非HSCT移植相关治疗方案中的抗癌免疫疗法。
[0009]自然杀伤细胞
[0010]NK细胞亚组和功能
[0011]NK细胞最初在70年代中期被鉴定为除了T细胞和B细胞以外的第三大淋巴细胞亚群(14
‑
17)。NK细胞是先天性免疫系统的重要效应细胞，因为它们可以在没有预先敏化即“自然”杀伤的情况下发挥快速效应功能。因此，NK细胞在早期防御病毒和细菌感染中以及在肿瘤免疫监视中起关键作用(18,19)。NK细胞存在于淋巴器官和各种非淋巴组织中。除了它们的细胞溶解活性以外，NK细胞能够产生多种多样的细胞因子和趋化因子来影响免疫系统的其他细胞区室(20,21)。NK细胞可以广义地定义为CD56
+
CD3
‑
淋巴细胞(占循环淋巴细胞群体的5％
‑
15％)(22)。基于CD56表达水平，可以将它们细分为两个主要亚组。CD56
暗淡
NK细胞(占外周血NK细胞的大约90％)具有显著的细胞溶解潜力，并且表达高水平的低亲和力Fc受体III(FcRγIII；被CD16识别)，从而允许它们介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(23,24)。相比之下，CD56
亮
NK细胞(占所有NK细胞的约10％)主要具有由INF
‑
γTNF
‑
α和GM
‑
CSF的有效产生介导的免疫调控功能。
[0012]NK细胞通过来自种系编码的抑制性受体(IR)或激活性受体(AR)的信号来识别并杀伤感染或恶性转化的细胞(25)。这些信号的组合平衡并调节NK细胞效应功能。当激活性信号占主导时，触发NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生。相比之下，当抑制占主导时，这些功能被阻断。激活后，NK细胞使用若干种杀伤机制裂解易感靶细胞(26)，这些若干种杀伤机制包括含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒的释放(27,28)、TRAIL依赖性细胞毒性和Fas介导的细胞凋亡的激活(28,29)。
[0013]NK细胞受体
[0014]NK细胞使用多种AR和IR来识别肿瘤细胞或病毒感染细胞(30
‑
32)。在人中，已描述了若干种类型的HLA I类特异性IR，包括识别成组的HLA I类分子的杀伤抑制性免疫球蛋白受体(KIR)和对呈递源自经典HLA I类分子的信号序列的肽的非经典HLA
‑
E分子具有特异性的CD94/NKG2A家族的c型凝集素受体(33,34)。这些受体的发现显现于显示NK细胞的细胞毒性由缺乏自身MHC I类分子的肿瘤细胞触发(这被称为，，自身缺失”识别)的早期观察结果。每个NK细胞表达抑制性受体和刺激性受体的不同组合，使得存在对自身MHC I类等位基因具有特异性的至少一种抑制性KIR。在稳态下，NK细胞由对否决潜在刺激信号的自身HLA I类分子的识别抑制。但在恶性转化的情况下，肿瘤细胞可以下调自身HLA I类表达或在HLA错配的移植环境中仅显示非自身HLA I类分子，同时上调触发NK细胞介导的肿瘤细胞裂解的激活性配体。在HSCT环境中，在供体NK细胞未出现针对接受者肿瘤细胞上存在的HLA配体的抑制性KIR的情况下，认为NK细胞发挥更高的GVT效应，因为它们潜在地较少受到现有“KIR
‑
配体”错配的抑制。在半相合异基因HSCT、脐带血(35)和异基因过继性NK细胞疗法的环境中的回顾性研究已显示，此，，KIR
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配体”错配可能是抗肿瘤作用的原因。
[0015]激活性信号由AR介导，其中除了上述CD16以外，最重要的受体是NKG2D、DNAM
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1以及自然细胞毒性受体(NCR)即NKp30、NKp44和NKp本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于产生干细胞、祖细胞、和/或NK细胞的集合的方法，所述方法包括以下步骤：(i)从包含CD34
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人干细胞的样品起始细胞培养并且将这些细胞在基本培养基中培养至少7天，该基本培养基包含干细胞因子(SCF)和白介素
‑
7(IL
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7)、以及flt
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3配体(FLT
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3L)和血小板生成素(TPO)中的一种或多种，其特征在于该细胞培养以12,000个CD34
+
细胞/ml或更少的细胞密度起始。2.根据权利要求1所述的方法，其中该细胞培养以在500与10,000个CD34
+
细胞/ml之间、更优选地在1,000与8,000个CD34+细胞/ml之间、更优选地在2,000与6,000个CD34+细胞/ml之间的细胞密度起始。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：(ii)将在步骤(i)中获得的细胞在包含IL
‑
15和IL
‑
7、以及SCF或FLT
‑
3L中的一种或多种的培养基中培养至少4天。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：(iii)将步骤(ii)中获得的细胞在包含细胞因子的集合的培养基中培养至少13天，从而获得含有多种NK细胞的培养细胞的集合，其中所述细胞因子的集合包含SCF、IL
‑
7、IL
‑
15和IL
‑
2中的三种或更多种。5.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中该方法在第12天导致细胞的至少150倍扩增、优选地至少200倍、更优选地至少300倍、最优选地至少500倍。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中该方法在第15天导致细胞的至少150倍扩增、优选地至少200倍、更优选地至少400倍、最优选地至少800倍。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中来自人胚后期组织的包含CD34
+
干细胞的该样品从人脐带血获得。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中来自人胚后期组织的包含CD34

【专利技术属性】
技术研发人员：福尔克尔，
申请(专利权)人：格雷克斯迪姆医疗私人有限公司，
类型：发明
国别省市：