定量测定新冠中和抗体的试剂及制备方法技术

一种定量测定新冠中和抗体的试剂及制备方法，包括：试剂一、试剂二与校准品；试剂一的核心成份为新冠假病毒，试剂一的缓冲剂为Tris,另外试剂一还含有蛋白酶抑制剂，BSA、甘油、蔗糖与咪唑作为蛋白蛋白保护剂及稳定剂，Proclin

【技术实现步骤摘要】
定量测定新冠中和抗体的试剂及制备方法


[0001]本专利技术属于生物医学检测
，尤其涉及一种定量测定新冠中和抗体的试剂及制备方法。

技术介绍

[0002]中和抗体是当病原微生物侵入机体时会产生相应的抗体。病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞。
[0003]中和抗体是由适应性免疫应答细胞分泌的一种可溶性蛋白。病毒侵入人体之后，免疫细胞把中和蛋白分泌到血液里，中和抗体与血液里的病毒颗粒结合，阻止病毒感染细胞，破坏病毒颗粒，这样就把病毒“中和”掉了。
[0004]目前的新冠中和抗体检测主要在生物安全三级实验室(BSL3)内进行。利用活病毒细胞培养的新冠中和试验检测，对实验室等级要求高，严重限制了临床大规模的推广使用。开发出可在生物安全二级实验室(BSL2)或普通实验室开展的快速新冠中和抗体检测方法，具有重要意义。当前也有一些研究团队开发了ELISA类测试，但此种方法操作复杂、耗时较长、对实验操作人源要求较高。也有一些团队开发了侧向层析类的测试，但此种方法不能准确定量、准确度较差，重复性较差。

技术实现思路

[0005]本专利技术的可定量测定样本中新冠中和抗体的浓度，量化评估疫苗免疫效果；操作简便；检测通量高使得一般每台仪器每小时可测试几百上千例样本；测定结果精密度良好；试剂成本较低。本专利技术的技术方案如下：本专利技术的所述定量测定新冠中和抗体的试剂，包括：试剂一、试剂二与校准品；试剂一的核心成份为新冠假病毒，试剂一的缓冲剂为Tris, 另外试剂一还含有蛋白酶抑制剂，BSA、甘油、蔗糖与咪唑作为蛋白蛋白保护剂及稳定剂， Proclin
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300作为试剂一的防腐剂；试剂二的核心成份为标记有ACE2的聚苯乙烯微球，试剂试剂二的缓冲剂为HEPES , 另外含有BSA作为试剂二的蛋白保护剂、蔗糖作为试剂二的稳定剂， Proclin
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300作为试剂二的防腐剂，试剂二的活化缓冲剂为PBS缓冲剂，试剂二还包括EDC溶液；校准品用基质血清将新冠中和抗体稀释成如下梯度：0、25ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500 ng/ml与1000ng/ml而制得。
[0006]进一步的，所述试剂一中的新冠假病毒的含量为50PFU/L，试剂一的缓冲剂Tris的含量为20mMmol /L 且ph值为7.5，所述试剂一中的蛋白酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白酶肽、EDTA与PMSF中的一种或者几种，所述蛋白酶抑制剂的含量为
0.5 mg/L到35mg/L；所述蛋白蛋白保护剂及稳定剂中的BSA的含量为2g/L、甘油的含量5v/v、蔗糖的含量为5g/L与咪唑的含量为5g/L；作为试剂一的防腐剂的Proclin
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300的含量为0.05%v/v。
[0007]进一步的，所述试剂二中的聚苯乙烯微球的粒径为300nm且质量浓度为10%，聚苯乙烯微球的含量为80ul，所述试剂二的活化缓冲剂PBS缓冲剂的含量为500ul，所述试剂二的EDC溶液的浓度为50mg/ml且含量为20ul，所述试剂二的ACE2的含量为300ug，所述试剂二的BSA占所述试剂二的体积百分比为5%，所述试剂二的蔗糖占所述试剂二的体积百分比为8%， 所述试剂二的Proclin
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300占所述试剂二的体积百分比为0.05%,所述试剂二的HEPES的含量为9ml的50mM的HEPES，HEPES的ph值为7.5。
[0008]进一步的，所述试剂一与试剂二的体积比为3:1。
[0009]进一步的，所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，包括：制备试剂一的方法，其包括：把含量为50PFU/L的新冠假病毒、含量为20mMmol /L 且ph值为7.5的Tris、含量为0.5 mg/L的蛋白酶抑制剂、含量为2g/L的BSA、含量为5v/v的甘油、含量为5g/L的蔗糖、含量为5g/L的咪唑与含量为0.05%v/v的Proclin
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300在常温下混合而成试剂一；进一步的，所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，还包括：制备试剂二的方法，其包括如下步骤：步骤1：稀释微球，即取试剂二的活化缓冲剂500ul, 加入80ul的聚苯乙烯微球，混匀,置于37℃环境中得到相应的溶液，所述聚苯乙烯微球的粒径为300nm且质量浓度为10%；步骤2：活化，即取20ul EDC溶液加入步骤1的所述相应的溶液中，混匀，置于37℃ 环境中活化15min得到活化液,所述EDC溶液的浓度为50mg/ml；步骤3：离心，即活化结束后，把活化液送入转速为10000r/min且离心时间设定成30min 的离心机中离心，去除上清，保留沉淀 ，沉淀即离心物；步骤4：耦联,即取4.0ml的50mM的HEPES将离心物超声分散， 然后加入300ug ACE2，混匀，置于37℃环境中搅拌耦联3小时得到耦联体，HEPES的ph值为7.5；步骤5：离心，即活化结束后，把耦联体送入转速为10000r/min且离心时间设定成30min 的离心机中离心，去除上清，保留沉淀 ，沉淀即离心体；步骤6：重悬，即取5.0ml的50mM的HEPES与占所述试剂二的体积百分比为5%的BSA作为蛋白保护剂，取占所述试剂二的体积百分比为8%的蔗糖作为稳定剂，把占所述试剂二的体积百分比为0.05%的Proclin作为防腐剂，把该蛋白保护剂、稳定剂和防腐剂加入离心体中制得试剂二，所述HEPES的ph值为7.5。
[0010]进一步的，所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，还包括：校准品的制备方法，其包括：用基质血清将新冠中和抗体稀释成如下梯度：0、25ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500 ng/ml与1000ng/ml而制得。
[0011]所述定量测定新冠中和抗体的试剂的测定方法为胶乳增强免疫比浊法和竞争法，也就是利用样本中的中和抗体与试剂二中标记在聚苯乙烯微球上的ACE2竞争结合试剂一中的假病毒，样本中的中和抗体越多，导致ACE2与RBD结合越少，反应形成的浊度越低，通过该浊度的下降程度推算出样本中的中和抗体浓度。
[0012]通过采用上述技术方案，达到的技术效果如下：
本专利技术的试剂可有效区分是否已接种新冠疫苗及是否产生相应抗体，并可给出定量结果，有效指导指导个体免疫接种方案的调整，判断是否需要调整免疫接种策略。提升群体免疫保护性的辅助支撑，具有重大意义。 另外，对于治愈后的新冠患者检测，可以判断是否存在再次感染的风险。
附图说明
[0013]图1为本专利技术的的所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法的步骤1到步骤3的流程图。
[0014]图2为本专利技术的所述定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法的步骤4到步骤6的流程图。
[0015]图3为本专利技术的检测仪器进行检测后得到的的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定量测定新冠中和抗体的试剂，其特征在于，包括：试剂一、试剂二与校准品；试剂一的核心成份为新冠假病毒，试剂一的缓冲剂为Tris, 另外试剂一还含有蛋白酶抑制剂，BSA、甘油、蔗糖与咪唑作为蛋白蛋白保护剂及稳定剂， Proclin
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300作为试剂一的防腐剂；试剂二的核心成份为标记有ACE2的聚苯乙烯微球，试剂试剂二的缓冲剂为HEPES , 另外含有BSA作为试剂二的蛋白保护剂、蔗糖作为试剂二的稳定剂， Proclin
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300作为试剂二的防腐剂，试剂二的活化缓冲剂为PBS缓冲剂，试剂二还包括EDC溶液；校准品用基质血清将新冠中和抗体稀释成如下梯度：0、25ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500 ng/ml与1000ng/ml而制得。2.根据权利要求1所述的定量测定新冠中和抗体的试剂，其特征在于，所述试剂一中的新冠假病毒的含量为50PFU/L，试剂一的缓冲剂Tris的含量为20mMmol /L 且ph值为7.5，所述试剂一中的蛋白酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白酶肽、EDTA与PMSF中的一种或者几种，所述蛋白酶抑制剂的含量为0.5 mg/L到35mg/L；所述蛋白保护剂及稳定剂中的BSA的含量为2g/L、甘油的含量5v/v、蔗糖的含量为5g/L与咪唑的含量为5g/L；作为试剂一的防腐剂的Proclin
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300的含量为0.05%v/v。3.根据权利要求1所述的定量测定新冠中和抗体的试剂，其特征在于，所述试剂二中的聚苯乙烯微球的粒径为300nm且质量浓度为10%，聚苯乙烯微球的含量为80ul，所述试剂二的活化缓冲剂PBS缓冲剂的含量为500ul，所述试剂二的EDC溶液的浓度为50mg/ml且含量为20ul，所述试剂二的ACE2的含量为300ug，所述试剂二的BSA占所述试剂二的体积百分比为5%，所述试剂二的蔗糖占所述试剂二的体积百分比为8%， 所述试剂二的Proclin
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300占所述试剂二的体积百分比为0.05%,所述试剂二的HEPES的含量为9ml的50mM的HEPES，HEPES的ph值为7.5。4.根据权利要求1所述的定量测定新冠中和抗体的试剂，其特征在于，所述试剂一与试剂二的体积比为3:1。5.一种定量测定新冠中和抗体的试剂的制备方法，其特征在于，包括：制备试剂一的方法，其包括：把含量为50PFU/L的新冠假病毒、含量为20mMmol /L 且ph...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉基，夏昌校，王鹏，
申请(专利权)人：南京立顶医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：