一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体及制备方法技术

本发明专利技术涉及糖化血红蛋白技术领域，尤其是一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体及制备方法，该单克隆抗体的序列如SEQ ID NO：1所示，其轻链可变区和重链可变区序列分别如SEQ ID NO：2

【技术实现步骤摘要】
一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体及制备方法


[0001]本专利技术涉及糖化血红蛋白
，具体领域为一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体及制备方法。

技术介绍

[0002]糖化血红蛋白是衡量血糖控制的金标准，也是诊断和管理糖尿病的重要手段。在糖尿病治疗中，糖化血红蛋白水平对评价血糖总体控制、发现治疗中存在的问题以及指导治疗方案均有重要的临床意义。
[0003]正常人有三种血红蛋白：HbA、HbF、HbA2，而成人红细胞中主要含有HbA。在用层析法分离血红蛋白时，可洗脱出3种含糖成分即：HbA1a、HbA1b、HbA1c，合称为糖化血红蛋白。HbA1c是葡萄糖化血红蛋白，另两种是其他糖形成的糖化血红蛋白。
[0004]糖化血红蛋白由HbA在代谢过程中与葡萄糖结合形成，因而它可准确地反映血中葡萄糖水平。糖化血红蛋白是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物。血糖和血红蛋白的结合生成糖化血红蛋白是不可逆反应，并与血糖浓度成正比，且保持120天左右，所以可以观测到120天之前的血糖浓度。糖化血红蛋白测试通常可以反映患者近8～12周的血糖控制情况。
[0005]糖化血红蛋白的免疫法测定是目前临床常用方法之一，其原理是采用能识别糖化血红蛋白β
‑
链氨基末端几个糖基化氨基酸的特异性抗体与HbA1c反应，形成抗原抗体复合物来进行检测。该类方法快速、简便，可在自动化仪器上检测。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体及制备方法。r/>[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体，其序列如SEQ ID NO：1所示。其中，轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。
[0009]本专利技术所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0010](1)免疫动物
[0011]选用6
‑
8周龄雌性BALB/c小鼠，免疫注射，抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞；
[0012](2)细胞融合
[0013]采用CO2气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液；将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇；在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞；
[0014](3)选择性培养
[0015]采用HAT选择性培养基筛选融合的杂交瘤细胞；
[0016](4)杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
[0017]采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养；筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增；经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存；
[0018](5)单克隆抗体纯化
[0019]使用硫酸铵盐析法和G蛋白层析法对小鼠腹水进行纯化；
[0020](6)单克隆抗体交联。
[0021]其中，所述步骤(1)具体为：
[0022]初次免疫，Ag50ug/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，一般1.5mL，间隔3周；
[0023]第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周；
[0024]第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，7天后采血测其效价，检测免疫效果，间隔3周；
[0025]加强免疫，剂量50μg，腹腔注射；3天后，取脾融合。
[0026]其中，所述步骤(2)具体包括：
[0027]1)饲养细胞的制备
[0028]用6
‑
10周龄的BALB/c小鼠；拉颈处死，浸泡于75％的酒精，消毒3min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜；用吸管注入6mL培养液，反复冲洗，吸出冲洗液；放入10mL离心管，1200rpm离心5min；
[0029]用20％小牛血清的培养液混悬，调整细胞数为1
×
105/mL；加入96孔板，100μL/孔；放入37℃孵箱培养；
[0030]2)骨髓瘤细胞的准备
[0031]于融合前48
‑
36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养；融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50m离心管或融合管内；1000r/min离心5
‑
10分钟，弃去上清；加入30mL不完全培养基，离心洗涤一次；然后将细胞重悬浮于10mL不完全培养基，混匀；取骨髓瘤细胞悬液，加0.4％台酚蓝染液作活细胞计数后备用；
[0032]3)脾细胞的准备
[0033]取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清；同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10mL不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织；置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基；用吸管吹打数次，制成单细胞悬液；通常每只小鼠1
×
108‑
2.5
×
108个脾细胞；
[0034]4)细胞融合
[0035]将1
×
108脾细胞与1
×
107骨髓瘤细胞SP2/0混合于一支50mL融合管中，补加不完全培养基至30mL，充分混匀；1000r/min离心5
‑
10分钟，将上清尽量吸净；在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀；
[0036]用1mL吸管在30s内加入预热的50％ PEG1 mL，边加边轻轻搅拌；吸入吸管静置1min；加入预热的不完全培养液，终止PEG作用，连续每2min内分别加入1mL，2mL，3mL，4mL，5mL，10mL；800rpm离心，5分钟；弃去上清；
[0037]加入5mL完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加完全培养基
至40
‑
50mL；分装96孔细胞培养板，每孔100μL，然后将培养板置37℃，5％ CO2培养箱内培养；6h后补加选择培养基；每孔50μL，3天后用选择培养基半换液；
[0038]观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
[0039]其中，所述步骤(3)具体为，抗原用包被液稀释至10ug/mL；以100μL/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时；弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干；每孔加100μL封闭液37℃封闭1小时；洗涤液洗3次；
[0040]每孔加100μL待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体，其特征在于：其序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体，其特征在于：轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。3.根据权利要求1所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体，其特征在于：重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)免疫动物选用6
‑
8周龄雌性BALB/c小鼠，免疫注射，抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞；(2)细胞融合采用CO2气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液；将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇；在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞；(3)选择性培养采用HAT选择性培养基筛选融合的杂交瘤细胞；(4)杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养；筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增；经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存；(5)单克隆抗体纯化使用硫酸铵盐析法和G蛋白层析法对小鼠腹水进行纯化；(6)单克隆抗体交联。5.根据权利要求4所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为：初次免疫，Ag50ug/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，1.5mL，间隔3周；第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周；第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，7天后采血测其效价，检测免疫效果，间隔3周；加强免疫，剂量50ug，腹腔注射；3天后，取脾融合。6.根据权利要求5所述的多聚体糖化血红蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)具体包括：1)饲养细胞的制备用6
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10周龄的BALB/c小鼠；拉颈处死，浸泡于75％的酒精，消毒3min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜；用吸管注入6mL培养液，反复冲洗，吸出冲洗液；放入10mL离心管，1200rpm离心5min；用20％小牛血清的培养液混悬，调整细胞数为1
×
105/mL；加入96孔板，100μL/孔；放入37℃孵箱培养；2)骨髓瘤细胞的准备
于融合前48
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36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养；融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50m离心管或融合管内；1000r/min离心5
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10分钟，弃去上清；加入30mL不完全培养基，离心洗涤一次；然后将细胞重悬浮于10mL不完全培养基，混匀；取骨髓瘤细胞悬液，加0.4％台酚蓝染液作活细胞计数后备用；3)脾细胞的准备取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清；同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10mL不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织；置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄善青，周康，袁超群，张玉基，王鹏，
申请(专利权)人：南京立顶医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：