靶向膜联蛋白A1的纳米抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体及其制备方法与应用，公开了一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb6，其中，所述纳米抗体Nb6的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示，提供的纳米抗体Nb4为与膜联蛋白A1就具有较高的亲和力，通过该抗体可靶向作用于膜联蛋白A1，与膜联蛋白A1高强度的结合能力，有利于开发与膜联蛋白A1的纳米抗体相关药物，实现对肿瘤进行靶向治疗和成像，具有非常大的临床应用价值。同时能够以该纳米抗体为基础制备分子探针，通过与肿瘤血管表面膜联蛋白抗原特异性结合，应用于肿瘤进行特异性成像和诊断；并且用于相关药物的递送，应用十分广泛。应用十分广泛。应用十分广泛。

【技术实现步骤摘要】
靶向膜联蛋白A1的纳米抗体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]药物是否有效取决于药物能否在靶标部位聚集并且发生作用。多数肿瘤化疗药物的治疗效果差以及毒副作用主要是因为药物的靶向性弱。针对不同肿瘤特异性高表达的蛋白设计靶点，能够让药物快速的聚集到靶点，降低药物的毒副作用。
[0003]膜联蛋白A1(Annexin A1,ANXA1)是一种受钙离子调节的磷脂结合蛋白，属于Ca
2+
依赖蛋白。人ANXA1由346个氨基酸(37Kda)组成。ANXA1蛋白在部分肿瘤细胞中大量表达，并且参与肿瘤细胞生存、增殖、凋亡、分化和迁移，它与肿瘤的起始、增殖和转移有关。ANXA1存在三个亚细胞定位：一个细胞质，第二个是细胞核，第三个是松散或紧密地附着在细胞膜上；针对不同的位置，ANXA1以不同的方式参与肿瘤的的发生，甲酰基多肽受体(Formyl peptide receptor,FPR)受体，是唯一已知的外分泌ANXA1受体；许多研究发现ANXA1/FPR复合体参与炎症、神经内分泌系统、调节骨骼肌分化和癌症进展，FPR可以被ANXA1激活，也可以被来自其N
‑
末端区域的合成肽激活，由于这些受体可以被各种合成的配体激活或沉默，它们是一个非常有吸引力的药理靶标家族。
[0004]其次，在人类的肿瘤中的血管内皮细胞膜中会形成小凹，小凹是一种特殊类型的脂筏，在许多细胞类型中，特别是在内皮细胞中，小凹是质膜的小内陷(50
‑
100nm)。它们经常与压力纤维联系在一起，以确保分子运输到细胞内，更重要的是穿过细胞。结果表明，内皮细胞小窝中表达的靶向蛋白可以将静脉注射的抗体特异性泵入肺内。ANXA1在人类肿瘤(乳腺、肾脏、肝脏、肺、脑和前列腺)的小窝中表达，在肿瘤微循环的管腔表面表达，但在正常血管中不表达。某些学者通过ANXA1全长抗体偶联Alexa Fluor488或者用放射性物质125I用于肿瘤血管成像以及治疗。这些潜在的发现表明ANXA1有望成为人类肿瘤成像、药物输送和内部放射治疗的靶点。
[0005]然而，目前没有与ANXA1蛋白高强度结合的纳米抗体，导致ANXA1蛋白靶点的有益性质得不到广泛的应用。

技术实现思路

[0006]本申请的目的在于提供一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体及其制备方法与应用，旨在解决现有技术中缺乏可靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，以至于无法更好地利用膜联蛋白A1靶点进行相关药物制备的问题。
[0007]为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
[0008]第一方面，本申请提供了一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb4，其中，所述纳米抗体Nb4的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。
[0009]第二方面，本申请提供了一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体的制备方法，包括如下
步骤：
[0010]将膜联蛋白A1进行表达纯化，得到膜联蛋白A1目的蛋白；
[0011]将所述膜联蛋白A1目的蛋白包被在免疫管上进行富集筛选，得到噬菌体文库；
[0012]将所述噬菌体文库的洗脱液进行PCR扩增并进行ELISA验证，再进行二代测序，并根据测序结果合成纳米抗体的基因序列；
[0013]将所述纳米抗体的基因序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将所述重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化，得到靶向膜联蛋白A1的纳米抗体。
[0014]第三方面，本申请提供了靶向膜联蛋白A1的纳米抗体在制备靶向膜联蛋白A1的分子探针中的应用。
[0015]第四方面，本申请提供了靶向膜联蛋白A1的纳米抗体在制备用于肿瘤靶向治疗的药物中的应用。
[0016]第五方面，本申请提供了靶向膜联蛋白A1的纳米抗体在免疫治疗以及纳米材料修饰的药物递送中的应用。
[0017]本申请第一方面提供的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb4，其中，所述纳米抗体Nb4的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示，提供的纳米抗体Nb4为与膜联蛋白A1就具有较高的亲和力，通过该抗体可靶向作用于膜联蛋白A1，与膜联蛋白A1高强度的结合能力，有利于开发与膜联蛋白A1的纳米抗体相关药物，实现对肿瘤进行靶向治疗和成像，具有非常大的临床应用价值。同时能够以该纳米抗体为基础制备分子探针，通过与肿瘤血管表面膜联蛋白抗原特异性结合，应用于肿瘤进行特异性成像和诊断；并且用于相关药物的递送，应用十分广泛。
[0018]本申请第二方面提供的一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体的制备方法，该制备方法基于噬菌体天然纳米抗体文库，完成三轮对膜联蛋白A1的筛选蛋白，通过ELISA验证，发现一条纳米抗体Nb4，同时与人膜联蛋白A1和鼠膜联蛋白A1均有较高的结合力，因此纳米抗体Nb4有着较好的应用价值，该制备方法快速、简便，有利于大量筛选，提高了筛选效率。
[0019]本申请第三方面提供的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体在制备靶向膜联蛋白A1的分子探针中的应用；由于得到的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体包括纳米抗体Nb4，其对膜联蛋白A1具有高强度的结合能力，因此，可以有利于开发与膜联蛋白A1的纳米抗体相关的分子探针，并且和放射性核素,近红外染料,超声微泡等相结合，通过与肿瘤血管表面膜联蛋白抗原特异性结合，可应用于对肿瘤进行特异性成像和诊断。
[0020]本申请第四方面提供的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体在制备用于肿瘤靶向治疗的药物中的应用，由于得到的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体包括纳米抗体Nb4，其对膜联蛋白A1具有高强度的结合能力，因此，有利于开发靶向膜联蛋白A1的纳米抗体在制备用于肿瘤靶向治疗的药物中的应用，且基于纳米抗体由于分子量小，可以穿过血脑屏障，与肿瘤血管表面相应抗原结合，实现对肿瘤的靶向治疗。
[0021]本申请第五方面提供了靶向膜联蛋白A1的纳米抗体在免疫治疗以及纳米材料修饰的药物递送中的应用，由于得到的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体包括纳米抗体Nb4，其对膜联蛋白A1具有高强度的结合能力，因此，可以有利于开发与膜联蛋白A1的纳米抗体相关药物，制备针对膜联蛋白A1设计的各种治疗方法，包括但不限于NDC(纳米抗体药物偶联)、双特异性抗体药物偶联药物，以及CAR
‑
T，CAR
‑
NK等免疫治疗以及相关纳米材料修饰的药物递
ID NO.3具体如下：WFRQAPGKEREFVA。
[0039]在一些实施例中，所述纳米抗体Nb4中，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.4具体如下：RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA。
[0040]在一些实施例中，所述纳米抗体Nb4中，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，SEQ ID NO.5具体如下：WGQGTQVTVSS。
[0041]在一些实施例中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb4，其中，所述纳米抗体Nb4的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；所述纳米抗体Nb4中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。3.根据权利要求1所述的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体Nb4的碱基序列如Seq.ID NO.9所示。4.一种权利要求1～3任一所述的靶向膜联蛋白A1的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将膜联蛋白A1进行表达纯化，得到膜联蛋白A1目的蛋白；将所述膜联蛋白A1目的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李金声，丁有斌，徐小龙，龙颖，贾琳，李茁，李志杰，王继刚，
申请(专利权)人：深圳市人民医院，
类型：发明
国别省市：