天然高纯度糖化血红蛋白HbA1c和血红蛋白HbA0的分离纯化方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其是一种天然高纯度糖化血红蛋白HbA1c和血红蛋白HbA0的分离纯化方法，包括以下步骤：(1)标本血红蛋白的提取；(2)配基的偶联；(3)血红蛋白分离纯化。本发明专利技术方法分离纯化得到的HbA1c可用于标准品的制备。其中，HbA1c和HbA0可以按照比例混合制备质控品和校准品，有利于各厂家和实验室的结果比较及质量控制；本发明专利技术方法分离纯化的HbA1c还可以作为免疫抗原来制备单/多克隆抗体，也可以作为酶联免疫吸附实验(ELISA)的包被抗原，检测抗体效价。其中，HbA0可以用于筛选检测糖化血红蛋白的单克隆抗体的特异性，避免非特异性结合。异性结合。异性结合。

【技术实现步骤摘要】
天然高纯度糖化血红蛋白HbA1c和血红蛋白HbA0的分离纯化方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体领域为一种糖化血红蛋白HbA1c和血红蛋白HbA0的分离纯化方法。

技术介绍

[0002]我国是全球糖尿病第一大国，患者数量居全球第一，并持续快速增长。据弗若斯特沙利文报告，2020年，中国成年人糖尿病患病率高达11.9％，2016年患病率为10.8％，患病率总体呈现不断上升的趋势。中国糖尿病患者数量已从2016年的1.2亿人增长至2020年的1.3亿人，约占中国总人口的10％，位列世界第一。我国糖尿病患病人数以3.0％的复合年增长率持续增长，预计在2022年达到1.41亿人。
[0003]正常人主要血红蛋白A包括与糖结合部分的HbA1和未结合糖部分的HbA0，其中HbA1包括HbA1a1、HbA1a2、HbA1b、HbA1c。HbA1c约占HbA1的80％。国际临床化学联合会(IFCC)把HbA1c定义为Hb1条或2条β链氨基末端与葡萄糖形成的稳定、不可逆的四聚体加成化合物(N
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脱氧果糖基
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种天然高纯度糖化血红蛋白HbA1c和血红蛋白HbA0的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：A.标本血红蛋白的提取；B.配基的偶联(1)将所需要偶联的糖化血红蛋白鼠单克隆抗体，溶解到含有NaCl的NaHCO3缓冲溶液中，加入处理好的CNBr Activated Seplife 4FF；(2)在室温中搅拌反应2～4小时或者在4℃下反应过夜；(3)反应完全后，先用偶联缓冲液洗涤掉多余的配体，然后用水洗涤；(4)将洗涤后的凝胶悬浮到水中，加入20mM Tris
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HCl pH8.0缓冲液，在常温下搅拌反应，消除残余活性基团；(5)用含有NaCl的醋酸盐缓冲液和含有NaCl的Tris
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HCl缓冲液交替洗涤，最后用PBS洗涤；C.血红蛋白分离纯化(1)将步骤A提取的样品上样至步骤B处理后的CNBr Activated Seplife 4FF；(2)高效液相色谱HPLC(MonoS)对纯化样品进行分析，鉴定纯度。2.根据权利要求1所述的天然高纯度糖化血红蛋白HbA1c和血红蛋白HbA0的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤A具体为，(1)将采血管中的外周静脉血混合，向离心管中加入抗凝血，离心5分钟；(2)离心结束后去除上层的血浆；(3)然后向离心管中加入生理盐水，用加液枪轻轻吹打混匀，将混匀后的离心管放入离心机离心5分钟；(4)离心结束后，弃掉上面的液体，再次向离心管中加入生理盐水，用加液枪轻轻吹打混匀，再次将混匀后的离心管放入离心机离心5分钟；(5)离心结束后，弃掉上面多余的生理盐水；(6)在离心管底轻轻吸取10μl红细胞，放入灭菌的1.5mLEP管中，再向所述EP管加入130μl的溶血液溶解；(7)将EP管放在振荡器上震荡，使液体混匀，最后在室温下赠育5min；(8...

【专利技术属性】
技术研发人员：周康，黄善青，张玉基，王鹏，
申请(专利权)人：南京立顶医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：