本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其是一种具有高稳定性和高反应度的脂联素ADP复性方法，包括以下步骤：A.脂联素ADP蛋白表达纯化：1)重组人ADP质粒转化；2)表达鉴定、优化及可溶性分析；3)包涵体清洗；4)放大表达与亲和纯化；B.高效体积排阻色谱法对重组人脂联素ADP蛋白复性。采用本发明专利技术方法，可获得性能更为优异的重组人脂联素，稳定高效、批间差小，可适于作为诊断试剂的抗原原料。断试剂的抗原原料。断试剂的抗原原料。
【技术实现步骤摘要】
一种具有高稳定性和高反应度的脂联素ADP复性方法
[0001]本专利技术涉及生物
，具体领域为一种脂联素ADP复性方法。
技术介绍
[0002]脂联素(ADP)是由脂肪细胞分泌的、对人体有保护作用的特异性脂肪因子，参与对代谢综合征、动脉硬化和II型糖尿病的保护。通过对人体的研究发现，脂联素水平能预示II型糖尿病和冠心病的发展，并在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力。
[0003]人脂联素由244个氨基酸组成，是一种血浆含量相对丰富的蛋白，其基因位于染色体3q27，这也是糖尿病易感基因所在处，相对分子质量为30KDa，是一种具有调节糖脂代谢、抗炎症反应、抗动脉粥样硬化等多重效应的脂肪细胞因子。
[0004]脂联素(ADP)的临床意义在于：(1)脂联素检测可提前4
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7年预测糖尿病发病风险，针对高危人群进行糖尿病筛查，有助于早期发现糖尿病。(2)通过体育锻炼、改变饮食生活方式等措施进行干预，以提高脂联素水平和增强胰岛素敏感性，达到逆转糖尿病进程的目的，从而避免糖尿病的发生。(3)通过普查脂联素水平，实现对糖尿病的一级防控，可降低发病率和并发症人数，提高人均寿命，提高人民幸福指数目标。(4)可实现糖尿病的早筛查、早干预，逆转病程，避免终身服药的悲剧。(4)用于评估药物治疗或生活方式干涉是否有效，并为制定有效的干预方案提供更全面的指导。
[0005]考虑到脂联素的分子亚型，将脂联素作为一种有前途的药物用于代谢综合征的研究需要大量生产这种激素。但是，目前还没有见到脂联素ADP复性的相关报道。
技术实现思路
[0006]针对上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种具有高稳定性和高反应度的脂联素ADP复性方法，可以提高脂联素ADP蛋白的产量，降低生产成本，提高生产效率，满足临床诊断需求。
[0007]本专利技术利用大肠杆菌(E.coli)生产重组人脂联素ADP，作为一种廉价、方便的原核表达系统，在药物治疗方面具有潜在的应用价值。通过大肠杆菌重组表达人脂联素ADP蛋白，发现大量ADP蛋白不可溶，包涵体是在某些生长条件下、致密聚集在大肠杆菌胞内水不溶性的颗粒结构，大小为0.1～5μm。一般含有50％以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂多糖等，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体形成的原因有很多，主要原因是重组蛋白在表达过程中缺乏某种辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键。表达量过高超过蛋白折叠的速度、二硫键的错误配对、蛋白质序列本身都可能导致包涵体的形成。从基因工程菌中收获包涵体，需要通过高压匀浆、超声波、酶溶等方法来破碎菌体，再离心除去可溶性蛋白获得粗制包涵体，这种粗制包涵体含有大量的杂质，如脂类、核酸、脂多糖等，为了获取该部分蛋白，节约成本，提高效率，本专利技术通过包涵体复性获取高稳定性和高反应度的蛋白。
[0008]具体而言，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]一种具有高稳定性和高反应度的脂联素ADP复性方法，包括以下步骤：
[0010]A.脂联素ADP蛋白表达纯化：
[0011](1)重组人ADP质粒转化
[0012]将含有ADP基因的pCold质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，涂氨苄板后37℃倒置培养过夜，所述脂联素ADP蛋白的序列为SEQ ID NO.1；
[0013](2)表达鉴定、优化及可溶性分析
[0014]①
选取单克隆于含30μg/mL氨苄霉素LB培养基37℃培养至菌体OD600为0.6
‑
0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃培养4h后离心，收菌制样；
[0015]②
向接有保种菌的培养基培养至菌体OD600为0.6
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0.8后的4管含30μg/mL氨苄霉素培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.2mM与1mM，分别在37℃和15℃220rpm培养4h和16h，诱导融合蛋白表达；
[0016]③
取上一步各条件菌液离心收集菌体，破碎，上清沉淀分别制样。
[0017](3)包涵体清洗：
[0018]①
将收集菌10g用缓冲液100mL(“50mM Tris，300mM NaCl”buffer，pH8.0)以1：10比例溶解菌体，用超声破碎仪，破碎功率1％，破碎时间10分钟，超3秒，停5秒；
[0019]②
离心12000rpm，30分钟，4℃，倒掉上清；
[0020]③
将沉淀溶解在(“50mM Tris，300mM NaCl”buffer，pH8.0，1％Triton X
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100，2MUrea)缓冲液中，搅拌2小时，8000rpm，10分钟，4℃，倒掉上清，重复该方法三次；
[0021]④
将沉淀溶解在“50mM Tris，300mM NaCl”buffer，pH8.0，8M Urea室温过夜搅拌。
[0022](4)放大表达与亲和纯化
[0023]表达最优克隆菌株37℃扩大培养于含30μg/mL氨苄霉素的LB培养基2L至OD600＝0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为1.0mM，15℃诱导16h收菌；
[0024]离心收菌，重悬菌体，超声破碎；
[0025]离心，上清进行Ni柱亲和层析纯化：
[0026]平衡缓冲液：“50mM Tris，300mM NaCl”buffer，pH8.0，8M Urea；
[0027]清洗缓冲液：“50mM Tris，300mM NaCl”buffer，pH8.0 with 20/40/60mM咪唑，8M Urea；
[0028]洗脱缓冲液：“50mM Tris，300mM NaCl”buffer，pH8.0 with 500mM咪唑，8M Urea；
[0029]制样SDS
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PAGE分析；
[0030]B.高效体积排阻色谱法对重组人脂联素ADP蛋白复性
[0031](1)将纯化洗脱样，上样至体积排阻色谱(Sephacryl High Resolution Superdex200)XK16mm*120cm柱体积150mL，流速1mL/min，蛋白复性缓冲液A(50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0)和蛋白变性缓冲液B(50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0，8MUrea)，蛋白变性缓冲液C(50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0，4MUrea)，蛋白变性缓冲液D(50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0，2MUrea)。
[0032](2)首先将缓冲液A上样78mL，然后将缓冲液D上样24mL，再将缓冲液C上样24mL，最后再将缓冲液B上样24mL，上样10mL变性重组人脂联素ADP蛋白，继续用缓冲液A做流动相，目的蛋白出峰体积60mL，将洗脱样蛋白上样10mL。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种具有高稳定性和高反应度的脂联素ADP复性方法，其特征在于：包括以下步骤：A.脂联素ADP蛋白表达纯化：(1)重组人ADP质粒转化将含有ADP基因的pCold质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，涂氨苄板后37℃倒置培养过夜，所述脂联素ADP蛋白的序列为SEQ ID NO.1；(2)表达鉴定、优化及可溶性分析；(3)包涵体清洗；(4)放大表达与亲和纯化；B.高效体积排阻色谱法对重组人脂联素ADP蛋白复性(1)将纯化洗脱样，上样至体积排阻色谱XK16mm*120cm柱体积150mL，流速1mL/min；蛋白复性缓冲液A为50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0；蛋白变性缓冲液B为50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0，8MUrea；蛋白变性缓冲液C为50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0，4MUrea；蛋白变性缓冲液D为50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0，2MUrea；(2)首先将蛋白复性缓冲液A上样，然后将蛋白复性缓冲液D上样，再将蛋白复性缓冲液C上样，最后再将蛋白复性缓冲液B上样，上样变性重组人脂联素ADP蛋白，继续用蛋白复性缓冲液A做流动相，目的蛋白出峰，将洗脱样蛋白上样。2.根据权利要求1所述的具有高稳定性和高反应度的脂联素ADP复性方法，其特征在于：所述步骤A中“表达鉴定、优化及可溶性分析”的具体方法为：
①
选取单克隆含30μg/mL氨苄霉素LB培养基37℃培养至菌体OD600为0.6
‑
0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃培养4h后离心，收菌制样；
②
向接有保种菌的培养基培养至菌体OD600为0.6
‑
0.8后的4管含30μg/mL氨苄霉素培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.2mM与1mM，分别在37℃和15℃220rpm培养4h和16h，诱导融合蛋白表达；
③
取上一步各条件菌液离心收...
【专利技术属性】
技术研发人员：周康，黄善青，张玉基，王鹏，卓浩，吴云萍，
申请(专利权)人：南京立顶医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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