一种具有双高特性的链球菌溶血素O蛋白的制备方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其是一种具有双高特性的链球菌溶血素O蛋白的制备方法，包括以下步骤：1)基因合成；2)载体构建；利用串联重复的SLO蛋白77AA

【技术实现步骤摘要】
一种具有双高特性的链球菌溶血素O蛋白的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体领域为一种具有双高特性的链球菌溶血素O蛋白的制备方法。

技术介绍

[0002]链球菌溶血素O蛋白(streptolysin0，SLO)是溶血性链球菌的代谢产物之一，具有溶血作用和强抗原性。链球菌溶血素O(SLO)是一种氧不稳定的胆固醇依赖性溶细胞素，是由大多数A组(GAS)菌株和许多C(GCS)和G(GGS)链球菌菌株产生的细胞外蛋白。
[0003]溶血性链球菌感染后患者体内可检SLO抗体，临床通过检测血清中有无SLO抗体产生(抗SLO试验)，可以诊断患者近期是否感染过溶血性链球菌，也可以用于辅助诊断风湿热、肾小球肾炎等。抗SLO试验的测定原理是以SLO为抗原的抗原抗体反应为基础。
[0004]SLO的来源包括以下途径：
[0005](1)天然蛋白获取。该方法稳定性好，批间差小，反应度高，但是不足之处是获取的蛋白量少。
[0006](2)通过链球菌培养获得。该方法获得的SLO的活性及抗原性较好，但是该方法的培养条件复杂、产量低、不易纯化，稳定性差和反应度低。
[0007]如CN103304645A、CN109153705A等文献所报道的SLO蛋白，实际应用中发现，这种重组蛋白不能很好地应用于链球菌相关检测等领域，例如ASO检测中试剂稳定性差，不能效控制批间差，不利于以SLO蛋白为核心原料的各种试剂的制备及SLO蛋白的工业化应用。
[0008]因此，开发一种批间差小、稳定性好、反应度高、产量高的链球菌溶血素O蛋白的制备方法成为了本领域亟需解决的技术难题之一。

技术实现思路

[0009]为了解决现有技术中上述问题，本专利技术提供了一种具有双高特性的链球菌溶血素O蛋白的制备方法，通过纯化重复的链球菌溶血素O蛋白(streptolysin0，SLO)，获取具有批间差小、稳定性好、反应度高的链球菌溶血素O蛋白。
[0010]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0011]一种具有双高特性的链球菌溶血素O蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0012](1)基因合成
[0013](2)载体构建
[0014]利用串联重复的SLO蛋白77AA
‑
571AA进行载体构建；SLO蛋白77AA
‑
571AA表示SLO蛋白全长序列第77位氨基酸到571位氨基酸，序列如SEQ ID NO:1所示；
[0015](3)菌种转化
[0016](4)链球菌溶血素O蛋白的纯化
[0017]1)挑取SLO 77AA
‑
571AA单菌落各一个，接种到5mL LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养5h；
[0018]2)将5mL LB培养的菌液接种到330mL LB培养基，共接2L，37℃，200rpm震荡培养3.5h时，加入79.2μL的IPTG；
[0019]3)37℃摇床继续培养18h，28℃，200rpm；
[0020]4)将菌体离心收集，10000rpm离心5min，去掉上清，加48mL非变性裂解液，加PSMF960μL，加溶菌酶480μL至1mg/ml，涡旋混匀后，4度摇床上放置30min，随后超声20min，4℃10500rpm离心40min，取上清进行蛋白分离纯化；
[0021]裂解缓冲液：10mM Tris
‑
HCl(pH 7.4)，500mM NaCl,10％glycerol，1mM PMSF，20mM imidazole，1mM DTT
[0022]缓冲液A:10mM Tris
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HCl(pH 7.4)，200mM NaCl，1mM DTT
[0023]缓冲液B:10mM Tris
‑
HCl(pH 7.4)，200mM NaCl，500mM imidazole，1mM DTT
[0024]平衡：10％缓冲液B，清洗：20％缓冲液B，洗脱：100％缓冲液B
[0025]将洗脱样用Smartdex
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G25层析柱脱盐至20mM PB(pH 7.4)，50mM NaCl，0.1％ P300中，蛋白浓度为2mg/mL。
[0026]其中，所述步骤(1)具体为：通过NCBI查找SLO核酸序列将进行进一步的分析，将SLO基因先拆分成500bp的分片段，分别合成，然后再进行组装；所述SLO核酸序列的基因登录号为WP_109821067；
[0027]引物的设计使用Oligo化学合成的方式，合成带有重叠区域的40nt的小片段引物使用重叠PCR的技术，将单链的引物拼装成双链的基因片段，通过连接转化、克隆筛选和测序验证以及突变修复，得到完全正确的SLO重组载体，通过无缝克隆或酶切组装技术，进一步将分片段拼接成全长后插入pUC系列载体，测序验证、酶切电泳方式对成品进行最终质量检测。
[0028]其中，所述步骤(2)具体为：将串联重复的SLO蛋白77AA
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571AA的基因插入到MCS位点的载体中，然后将该重组DNA分子转化到相容的细菌宿主中；ori位点促进重组质粒在宿主体内的复制；在转化细胞多次分裂后，在添加了抗生素的选择性培养基上获得重组克隆；用重组质粒转化的细胞只能在选择性培养基上生长；其中，串联重复是指相同的蛋白序列重复一次。
[0029]其中，所述步骤(3)具体为：
[0030]1)事先将恒温水浴的温度调到42℃；
[0031]2)从
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70℃超低温冰柜中取出一管感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5～10min；
[0032]3)加入5μl连接好的质粒混合液，轻轻震荡后放置冰上20min；
[0033]4)轻轻摇匀后插入42℃水浴中1～2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3～5min；
[0034]5)在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h；
[0035]6)在超净工作台中取上述转化混合液100～300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀；
[0036]7)通过蓝白斑筛选，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2％ X
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gal，8μl 20％ IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀；
[0037]8)在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30
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60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜；
[0038]9)观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好，注意白色菌斑。
[0039]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0040](1)本专利技术通过双高特性(即高反应度和高稳定性)的串联的SLO蛋白重组表达法获本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有双高特性的链球菌溶血素O蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)基因合成(2)载体构建利用串联重复的SLO蛋白77AA
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571AA进行载体构建；SLO蛋白77AA
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571AA表示SLO蛋白全长序列第77位氨基酸到571位氨基酸，序列如SEQ ID NO:1所示；(3)菌种转化(4)链球菌溶血素O蛋白的纯化1)挑取SLO 77AA
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571AA单菌落各一个，接种到5mL LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养5h；2)将5mL LB培养的菌液接种到330mL LB培养基，共接2L，37℃，200rpm震荡培养3.5h时，加入79.2μL的IPTG；3)37℃摇床继续培养18h，28℃，200rpm；4)将菌体离心收集，10000rpm离心5min，去掉上清，加48mL非变性裂解液，加PSMF960μL，加溶菌酶480μL至1mg/ml，涡旋混匀后，4度摇床上放置30min，随后超声20min，4℃10500rpm离心40min，取上清进行蛋白分离纯化；裂解缓冲液：10mM Tris
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HCl(pH 7.4)，500mM NaCl,10％glycerol，1mM PMSF，20mM imidazole，1mM DTT；缓冲液A:10mM Tris
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HCl(pH 7.4)，200mM NaCl，1mM DTT；缓冲液B:10mM Tris
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HCl(pH 7.4)，200mM NaCl，500mM imidazole，1mM DTT；平衡：10％缓冲液B，清洗：20％缓冲液B，洗脱：100％缓冲液B；将洗脱样用Smartdex
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G25层析柱脱盐至20mM PB(pH 7.4)，50mM NaCl，0.1％P300中，蛋白浓度为2mg/mL。2.根据权利要求1所述的具有双高特性的链球菌溶血素O蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：通过NCBI查找SLO核酸序列将进行进一步的分析，将SLO基因先拆分成500bp的分片段，分别合成，然后再进行组装；所述SL...

【专利技术属性】
技术研发人员：周康，黄善青，耿桂冠，张玉基，王鹏，
申请(专利权)人：南京立顶医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：