一种粒径与表面标志物联合分析的方法技术

本发明专利技术公开了一种粒径与表面标志物联合分析的方法。所述方法包括：1)从单外泌体尺度对外泌体蛋白标志物与粒径进行关联分析；2)统计不同外泌体蛋白标志物所对应的不同亚型的外泌体的数量及粒径分布；3)按照特定的粒径范围将外泌体分为不同的亚群，分别统计亚群中特异性表达某种标志物的外泌体比例；4)结合算法分析不同分型的外泌体亚型。利用本发明专利技术能够提高外泌体粒径检测的灵敏度并对外泌体的粒径以及膜蛋白进行检测；更重要的，能够对外泌体内部存在的亚群进行粒径与蛋白表达的关联性分析，提高不同类型癌症判别的准确度。提高不同类型癌症判别的准确度。

【技术实现步骤摘要】
一种粒径与表面标志物联合分析的方法


[0001]本专利技术属于体外诊断
，具体涉及一种粒径与表面标志物联合分析的方法。

技术介绍

[0002]外泌体是由细胞分泌的、直径在30
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150nm的磷脂双分子层膜结构。正常细胞与肿瘤细胞都可以分泌外泌体。外泌体内部包含有多种功能性物质，例如核酸、蛋白、氨基酸小分子等，这些物质能够反映其来源细胞的特征。由于这些功能性物质的存在，外泌体在细胞交流、免疫应答及癌症扩散等生命过程中也发挥了不可替代的作用。由于细胞来源、癌症基因突变及其他环境因素的不同，外泌体在膜蛋白组成、尺寸及内容物的含量等方面也存在异质性。这些异质性也使得外泌体成为癌症诊断领域最有前景的生物标志物之一。例如，通过检测乳腺癌外泌体的膜蛋白，可以分区正常人、普通乳腺癌患者及转移型乳腺癌患者。检测七种外泌体表面膜蛋白，也可以对乳腺癌、肝癌、肺癌、淋巴癌、卵巢癌及前列腺癌等六种不同癌症进行区分，准确率可达71％。
[0003]尽管外泌体的尺寸分布在30
‑
150nm，在如此小的粒径范围内，也存在不同的亚群。2018年David Lyden教授课题组利用非对称流体装置将粒径在30
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120nm范围的外泌体进一步分离，得到Exomere(<50nm)、Exo
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S(60
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80nm)以及Exo
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L(90
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120nm)三个亚群。结合非标蛋白质组学分析，共有64种蛋白质在Exomere亚群中高表达，99种蛋白质是Exo
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S及Exo
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L特有的。其中与代谢相关的蛋白多集中在Exomere亚群中，一些控制多糖折叠的蛋白质也被富集到Exomere亚群中，说明Exomere亚群可能通过糖蛋白与受体细胞特异性识别，并介导受体细胞的糖基化过程。这项研究说明，由于粒径差异也会导致外泌体膜蛋白质分布的差异，某些蛋白质仅分布在某个粒径范围内，并非全部粒径的外泌体都会表达。然而，传统的分析方法只针对全部粒径的外泌体进行分析，得到的信息包含所有亚群的特征，这使得我们得到的信号具有极大的背景噪音。
[0004]目前，外泌体的亚型分析依赖于亚型的分离。外泌体分离最常用的是超速离心法。该方法原理为利用超高速离心机，对收集到的液体样本采用一系列从小到大的离心力，最终将细胞分泌的外泌体沉淀。具体过程为300g，4度离心10分钟去掉悬浮细胞，收集上清液；将上清液在2000g，4度离心30分钟，去掉细胞碎片，收集上清液；将上清液在10000g，4度离心1小时，将粒径较大的细胞外囊泡沉淀，弃去沉淀，收集上清液；用0.22微米滤膜将上清液过滤，接着将上清液在100000g下离心2小时，即可得到外泌体沉淀；收集沉淀，用30毫升PBS溶液溶解，并再一次在100000g下离心2小时，洗去外泌体沉淀中的蛋白，即可得到比较纯的外泌体样本。超速离心也可以借助蔗糖或者碘克沙醇等物质产生密度梯度，对不同密度大小的囊泡进行分离，可粗略获取外泌体样本。除了超速离心外，也有SBI等公司推出外泌体提取试剂盒，利用免疫磁珠对液体中的外泌体进行捕获。已有文献也有各种未推向市场的外泌体分离技术。例如，可利用微流控通道结合非牛顿流体(例如，λ
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DNA)对不同尺寸的细胞外囊泡进行粗略区分，对不同亚群的膜蛋白进行分析，可对乳腺癌的不同分型进行检测。
在流体通道中，尺寸不同的囊泡受到非牛顿流体的惯性升力、黏性升力与粘滞阻力的共同作用，使得20
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200nm、200
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1000nm及大于1000nm的三种囊泡分别从通道的不同位置流出，从而达到与粒径相关的不同亚群的粗略分离。
[0005]表面声波技术可以与微流控相结合，利用一对叉指电极在表面产生驻波，可将200nm以下的粒子聚集在通道中心，而大于200nm的颗粒从通道的两侧流出，达到粗略分离外泌体的目的。
[0006]以上两种方式只能将200nm以下的外泌体全部分离出来，并不能进行更精细的亚群分离。而从最新的研究来看，30
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200nm的外泌体也存在高度异质性。因此，仅仅分离出200nm以下的外泌体并不能满足精准诊断的需求。Haiying Zhang等研究人员通过对非对称流体技术(Asymmetric
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Flow Field
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Flow Fractionation(AF4)technology)进行改进，可进一步将30
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200nm的外泌体分离为小于50nm，60
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80nm及90
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120nm的三个亚群。分离装置通常是一个薄而平坦的通道，高度在50微米和500微米之间变化。两个相互垂直的流场被同时加载在流道中，平行于通道的流体形成层流，带动样品向前流动，垂直于通道的流体推动样品在通道底部聚集。分子的布朗运动导致它们向通道内部扩散。因此，这两种驱动力的平衡将通道内相对于底壁的不同层的样品分离，并在不同的时间点将其洗脱。样品离底壁越高，样品所在层的流速越快。因此，处于较高位置的粒子将比处于较低位置的粒子更早地被洗出通道。不同类型的外部场，如离心产生的重力场、温差、电场和交叉流，根据不同的固有生物物理性质，被应用于分离样品。在AF4中，底壁被一个具有特定截止尺寸的半透膜所取代，允许低于截止尺寸的溶剂和小分子渗透，但保留大于截止尺寸的样品组分。垂直于流体通道的横流是样品在底壁(在本例中是膜)积累的驱动力。样品的分离完全由其固有扩散系数的差异决定。可调节的交叉流使AF4成为一种强大的分馏技术，具有很大的灵活性，以适应大尺寸范围的样品。此外，由于其与有机和水缓冲液的兼容性，AF4已被广泛用于表征生物和非生物分析物，如蛋白质、质粒、多糖、脂蛋白、病毒和病毒样颗粒、脂质体和各种聚合物。
[0007]除了上述流体技术之外，尺寸排阻色谱也可以根据颗粒的尺寸大小对样品进行分离。这是液相色谱的一种，其分离机理是立体排阻，仅与颗粒的尺寸相关，样品与固定相之间不存在相互作用。色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。凝胶的孔穴大小与被分离的试样大小相当。仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出入。对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔，甚至于完全被排斥。小个的组分分子，大孔小孔都可以渗进去，甚至进入很深，一时不易洗脱出来。因此，大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗出，它的洗脱体积(即保留时间)很小。小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积(即保留时间)较大，直到所有孔内的最小分子到达柱出口，这种按分子大小而分离的洗脱过程才告完成。
[0008]除了外泌体的亚群分离存在技术难度之外，单个外泌体的精准分析也是本领域的热点。目前外泌体的分析技术一般针对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种粒径与表面标志物联合分析的方法，其特征在于，所述方法包括：1)从单外泌体尺度对外泌体蛋白标志物与粒径进行关联分析；2)统计不同外泌体蛋白标志物所对应的不同亚型的外泌体的数量及粒径分布；3)按照特定的粒径范围将外泌体分为不同的亚群，分别统计亚群中特异性表达某种标志物的外泌体比例；4)结合算法分析不同分型的外泌体亚型。2.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)中所述亚群的数量为3个以上，例如使用30
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70nm、70
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120nm和120
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160nm三种粒径范围；和/或，步骤3)中统计亚群中特异性表达某种标志物的外泌体比例的具体方法为：3
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1)分别统计在抗体修饰的芯片表面特异性贴附的外泌体群体中，所选粒径范围内的外泌体数量n；3
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2)统计在正电修饰的芯片表面无差别贴附的外泌体群体中，所选粒径范围内的外泌体数量N；3
‑
3)用n/N即可得到特异性表达该标志物的外泌体的比例，即某种标志物在该亚群中的表达量；和/或，步骤4)还包括利用时间数量曲线，采用指数公式y＝a(1
‑
e
‑
bx
)做指数拟合，其中b表征结合动力学快慢，a表征饱和时吸附的最大数量；提取动力学参数b。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中曲线拟合采用Matlab、Origin或Python通用软件平台；和/或，步骤4)中需要分别对外泌体总体、外泌体亚群的结合动力学曲线进行参数拟合，并分别记录这些参数信息。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，用于算法分析的数据输入集包括，实验中选择的几种标志物在外泌体群体中的总体表达量、在外泌体亚群中的表达量，外泌体群体的结合动力学参数、外泌体几个亚群中的结合动力学参数；所述的输入数据集中，每次测试须有20
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30次重复测试。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)包括以下步骤：4
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1)将数据集划分成两类，其中三分之二用于模型建立、剩余的三分之一用于模型预测；4
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2)以线性判别分析LDA为例，将数据输入、软件自动拟合参数、建立线性判别模型；4
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3)模型预测，将剩余数据输入建立好的线性判别模型中，可根据模型输出结果，预测输入的数据来自于哪种癌症，达到癌症判别的目的；4
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4)模型判别准确率计算，统计判别正确的数量m及输入模型的总数M，由m/M即可得到模型判别准确率。6.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，使用干涉型等离子体显微镜进行所述关联分析；较佳地，所述关联分析包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：余辉，杨玉婷，翟春荟，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：