一种重组转氨酶及其在制备尼拉帕利手性中间体中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组转氨酶及其在制备尼拉帕利手性中间体中的应用，该重组转氨酶来源于分支杆菌属(Arthrobacter sp)KNK168的编号AT31转氨酶；其中，AT31转氨酶的核苷酸序列编码如SEQ No.1所示。本发明专利技术将该重组转氨酶应用于尼拉帕利手性中间体的制备，具有反应条件温和、效率高、立体和区域选择性高和环境友好特点，有效避免了低效的拆分或制备规模的手性色谱和毒性较大的有机溶剂的使用。色谱和毒性较大的有机溶剂的使用。

【技术实现步骤摘要】
一种重组转氨酶及其在制备尼拉帕利手性中间体中的应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及到一种重组转氨酶及其在制备尼拉帕利手性中间体中的应用。

技术介绍

[0002]尼拉帕利(Niraparib，CAS：1038915
‑
60
‑
4)，其化学结构如化学式1所示，化学名：2
‑
[4
‑
((3S)
‑3‑
哌啶基)苯基]‑
2H
‑
吲哚
‑7‑
甲酰胺，是一种聚腺苷二磷酸核糖体聚合酶抑制剂，广泛用于复发性卵巢癌的晚期维持治疗，可显著延长病人的生存期并减少复发。
[0003][0004]尼拉帕利的化学合成路线有三种，Jones P等发表的第一代合成路线，第二代合成路线同样由Jones P等通过改良第一代方案得到，第三代合成路线由美国默克公司开发。
[0005]第一代合成手性中间体的方法，如图1所示，具体为：以对硝基碘苯和3
‑
吡啶硼酸为原料，通过suzuki偶联反应，氢化还原反应，酒石酸拆分获得关键手性中间体4
‑
(3S
‑
哌啶
‑3‑
基)苯胺。
[0006]第二代合成手性中间体的方法通过改良第一代得到，如图2所示，为了提高Suzuki交叉偶联催化剂的稳定性，将催化剂改为负载更低的PdCl2(dppf)，同时使用4
‑
溴
‑1‑
硝基苯替代1
‑
碘
‑4‑
硝基苯作为偶联剂，并使用色谱分离对手性中间体胺进行拆分。该工艺虽然提高了手性中间体胺的产率，但由于使用了色谱分离柱对其进行手性拆分，工艺成本高，不利于工业化放大制备。
[0007]第三代合成手性中间体的方法由默克公司开发，采用化学
‑
酶法合成，但仍然存在合成路线长、总收率较低的问题。

技术实现思路

[0008]针对上述的不足，本专利技术的目的是提供一种重组转氨酶及其在制备尼拉帕利手性中间体中的应用，通过选用源自节杆菌属(Arthrobacter sp)KNK168的编号AT31转氨酶(其核苷酸序列编码如SEQ No.1所示)并采用本领域常规方法获得重组转氨酶，该重组转氨酶应用于尼拉帕利手性中间体的制备，具有反应条件温和、效率高、立体和区域选择性高和环境友好特点，有效避免了低效的拆分或制备规模的手性色谱和毒性较大的有机溶剂的使用。
[0009]为达上述目的，本专利技术采取如下的技术方案：
[0010]本专利技术提供一种重组转氨酶，其来源于分支杆菌属(Arthrobacter sp)KNK168的编号AT31转氨酶；其中，AT31转氨酶的核苷酸序列编码如SEQ No.1所示。
[0011]本专利技术还提供上述重组转氨酶的制备方法，包括以下步骤：
[0012]步骤(1)：将包括SEQ No.1所示的转氨酶基因的质粒和pET28a载体用同样的限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收双酶切片段，经T4 DNA连接酶连接，形成重组表达质粒AT31
‑
pet28a；
[0013]步骤(2)：将步骤(1)得到的重组表达质粒AT31
‑
pet28a转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)，即可获得基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/AT31
‑
pet28a；
[0014]步骤(3)：将步骤(2)得到的基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/AT31
‑
pet28a接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.8时，加入终浓度为0.05～1.2mmol/L的异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度10～40℃，即可表达所述的重组转氨酶。
[0015]本专利技术还提供上述重组转氨酶在制备尼拉帕利手性中间体(S)
‑5‑
(4
‑
溴苯基)哌啶
‑2‑
酮中的应用。
[0016]一种制备尼拉帕利手性中间体(S)
‑5‑
(4
‑
溴苯基)哌啶
‑2‑
酮的方法，包括以下步骤：
[0017]步骤(1)：将溴苯与琥珀酸酐混合，冰浴降温至2
‑
5℃；然后加入三氯化铝，室温反应3～6h，反应完毕后分离纯化，制得4
‑
(4
‑
溴苯基)
‑4‑
氧丁酸；其中，溴苯、琥珀酸酐和三氯化铝的质量比为180～200:15～25:45～60；
[0018]步骤(2)：将步骤(1)所得的4
‑
(4
‑
溴苯基)
‑4‑
氧丁酸和DMAP(4
‑
二甲氨基吡啶)加入醇类溶剂中溶解后冰浴，二环己基碳二亚胺(DCC)用醇类溶剂溶解后缓慢滴加入反应液，反应完毕后分离纯化，制得4
‑
(4
‑
溴苯基)
‑4‑
氧代丁酸异丙酯；其中，4
‑
(4
‑
溴苯基)
‑4‑
氧丁酸、二环己基碳二亚胺和4
‑
二甲氨基吡啶的质量比为15～25:3～8:0.1～1；
[0019]步骤(3)：在惰性气体保护下，将NaH置于反应容器中，加入1有机溶剂搅拌溶解；取Me3SOI溶解于有机溶剂中，缓慢加入至NaH溶液中，制备叶立德试剂；将步骤(2)所得的4
‑
(4
‑
溴苯基)
‑4‑
氧代丁酸异丙酯用有机溶剂溶解后缓慢加入至上述叶立德试剂中，室温反应10～15min，升温至50～70℃反应25～55min；反应完成后分离纯化，制得4
‑
(4
‑
溴苯基)
‑5‑
氧代丁酸异丙酯；
[0020]步骤(4)：以步骤(3)所得的4
‑
(4
‑
溴苯基)
‑5‑
氧代丁酸异丙酯为反应底物，上述重组转氨酶作为生物催化酶和吡哆醛
‑5‑
磷酸酯(PLP)为辅酶，i
‑
PrNH2为胺供体，酶法催化制得尼拉帕利手性中间体(S)
‑5‑
(4
‑
溴苯基)哌啶
‑2‑
酮；其中，4
‑
(4
‑
溴苯基)
‑4‑
氧代丁酸异丙酯、重组转氨酶、吡哆醛
‑5‑
磷酸酯和i
‑
PrNH2的质量比为1:50～1:5～0.01～0.1:1:100。
[0021]进一步地，步骤(1)中溴苯、琥珀酸酐和三氯化铝的质量比优选为188本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组转氨酶，其特征在于，所述重组转氨酶来源于分支杆菌属(Arthrobacter sp)KNK168的编号AT31转氨酶；其中，所述AT31转氨酶的核苷酸序列编码如SEQ No.1所示。2.一种权利要求1所述的重组转氨酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：将包括SEQ No.1所示的转氨酶基因的质粒和pET28a载体用同样的限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收双酶切片段，经T4 DNA连接酶连接，形成重组表达质粒AT31
‑
pet28a；步骤(2)：将步骤(1)得到的重组表达质粒AT31
‑
pet28a转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)，即可获得基因工程菌株E.coliBL21(DE3)/AT31
‑
pet28a；步骤(3)：将步骤(2)得到的基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/AT31
‑
pet28a接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.8时，加入终浓度为0.05～1.2mmol/L的异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度10～40℃，即可表达所述的重组转氨酶。3.权利要求1所述的重组转氨酶在制备尼拉帕利手性中间体(S)
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(4
‑
溴苯基)哌啶
‑2‑
酮中的应用。4.一种制备尼拉帕利手性中间体(S)
‑5‑
(4
‑
溴苯基)哌啶
‑2‑
酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：将溴苯与琥珀酸酐混合，冰浴降温至2
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5℃；然后加入三氯化铝，室温反应3～6h，反应完毕后分离纯化，制得4
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(4
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溴苯基)
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氧丁酸；其中，溴苯、琥珀酸酐和三氯化铝的质量比为180～200:15～25:45～60；步骤(2)：将步骤(1)所得的4
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(4
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溴苯基)
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氧丁酸和4
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二甲氨基吡啶加入醇类溶剂中溶解后冰浴，二环己基碳二亚胺用醇类溶剂溶解后缓慢滴加入反应液，反应完毕后分离纯化，制得4
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(4
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溴苯基)
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氧代丁酸异丙酯；其中，4
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(4
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溴苯基)
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氧丁酸、二环己基碳二亚胺和4
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二甲氨基吡啶的质量比为15～25:3～8:0.1～1；步骤(3)：在惰性气体保护下，将NaH置于反应容器中，加入1有机溶剂搅拌溶解；取Me3SOI溶解于有机溶剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓鹏，邱康，陆群，
申请(专利权)人：西南交通大学，
类型：发明
国别省市：