一种引物组合及利用其鉴定硫酸软骨素生物来源的方法技术

本发明专利技术公开了一种引物组合及利用其鉴定硫酸软骨素生物来源的方法。所述引物组合包括至少一引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物选自如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列中的一种或多种；所述下游引物选自如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10所示的核苷酸序列中的一种或多种。本发明专利技术还公开了包含所述引物组合的试剂盒，以及所述引物组合、试剂盒在鉴定硫酸软骨素生物来源中的应用。本发明专利技术能较好地对市场上鲨鱼、鸡、猪、牛来源的硫酸软骨素进行鉴别，尤其是对DNA含量过低或破坏严重的硫酸软骨素样品进行生物来源鉴定。重的硫酸软骨素样品进行生物来源鉴定。

【技术实现步骤摘要】
一种引物组合及利用其鉴定硫酸软骨素生物来源的方法


[0001]本专利技术属于质量检测领域，具体涉及一种引物组合及利用其鉴定硫酸软骨素生物来源的方法。

技术介绍

[0002]硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)是来自于鸡胸骨，猪软骨、喉骨，牛羊鼻骨、喉骨、软肋、气管、月牙骨、杂软骨，鲨鱼软骨、牙尖骨等富软骨组织的一类重要酸性高分子粘多糖。其主链是D
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葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖交替连接的双糖聚合物。
[0003]不同来源的硫酸软骨素具有不同的作用。据报道海参硫酸软骨素对大鼠酒精性胃溃疡具有保护作用，对小鼠肿瘤生长和转移有抑制作用；从黄鳝提取的硫酸软骨素具有降血脂和降血糖的功效；鲨鱼硫酸软骨素具有抗炎、抗病毒和抗动脉硬化的功效。同时，不同来源的硫酸软骨素在市场价格上也有很大的差异，其中以鲨鱼硫酸软骨素最为昂贵。因此对市场上的硫酸软骨素进行准确鉴定有着重要的意义。
[0004]目前硫酸软骨素鉴定方法主要有红外光谱法、液相分析法和PCR法。其中红外光谱法通过分析样本中是否存在6
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硫酸基团或4
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硫酸基团来进行判别；液相分析法是通过对硫酸软骨素进行酶解，然后分析酶解片段的相对峰面积。由于不同厂家的硫酸软骨素制备方式各有不同，同时相同来源的生物大分子也存在不均一性。这两种方法准确度不高，重复性较差，只能用于辅助分析。
[0005]PCR法是鉴定生物样品来源最准确的方法。GBT21101
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2007(猪)、GBT21104
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2007(牛)、SNT2978
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2011(鸡)、SNT3647
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2013(鲨鱼)对硫酸软骨素的物种来源分析都采用PCR法。
[0006]这些标准文件主要包括三个步骤：(1)从样品中提取DNA；(2)分别设计属于鸡猪牛羊的特异性引物进行扩增；(3)通过测序确认样品的生物来源。
[0007]但这种方法有三个主要问题：
[0008]①
没有考虑到样品中的DNA含量过少导致无法实现扩增。
[0009]②
没有考虑到样品中的DNA严重破碎，可能有大量缺失以至于设计的特异性引物对应的DNA片段可能根本不存在。
[0010]③
没有考虑到样品掺假的情况。比如有的标准文件规定从样品中检测到鲨鱼序列则判定为鲨鱼来源，没有考虑到其他来源的硫酸软骨素和鲨鱼硫酸软骨素混合掺假的情况。
[0011]现有技术缺乏一种能够准确鉴定硫酸软骨素生物来源的方法。

技术实现思路

[0012]为了克服现有技术中利用PCR扩增特异性片段鉴别硫酸软骨素生物来源中常会遇到样本中DNA含量极低且破坏严重的情况，以至于目标片段不存在而造成假阴性结果的技术问题，本专利技术旨在提供一种利用PEP扩增技术鉴定硫酸软骨素生物来源的方法。
[0013]为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案之一为：一种引物组合，所述引物组合能够特异性扩增出鸡、猪、牛和鲨鱼共有的保守序列，同时所述引物之间不会形成引物二聚体或引物多聚体。
[0014]在本专利技术的优选实施方案中，所述保守序列为线粒体DNA中的保守序列。
[0015]在本专利技术的具体实施方案中，所述引物组合包括至少一引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物选自如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列中的一种或多种；所述下游引物选自如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列中的一种或多种。
[0016]当体系中存在多条上游引物和/或多条下游引物混合扩增时，可能会出现上下游引物之间交叉组合扩增的片段(例如核苷酸序列为SEQ ID NO:1的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO:4的下游引物扩增的片段)，这能够提高目的片段被扩增出来的概率。
[0017]在本专利技术的具体实施方案中，所述引物组合包含以下一对或多对引物对：
[0018]上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:1，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:2；和/或，
[0019]上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:3，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:4；和/或，
[0020]上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:5，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:6；和/或，
[0021]上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:7，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:8；和/或，
[0022]上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:9，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:10。
[0023]在本专利技术的优选实施方案中，所述引物组合由以下引物对组成：
[0024]上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:1，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:2；
[0025]上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:3，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:4；
[0026]上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:5，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:6；
[0027]上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:7，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:8；和
[0028]上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:9，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:10。
[0029]为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案之二为：一种鉴定硫酸软骨素生物来源的试剂盒，所述试剂盒包含本专利技术技术方案之一所述的引物组合。
[0030]在本专利技术的优选实施方案中，所述试剂盒还包含DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs和/或去离子水。
[0031]在本专利技术的优选实施方案中，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。
[0032]在本专利技术的优选实施方案中，所述试剂盒还包含镁离子。
[0033]为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案之三为：一种鉴定硫酸软骨素生物来源的方法，所述方法包含以下步骤：
[0034]步骤(1)：从含硫酸软骨素的样品中提取获得分离的DNA。
[0035]步骤(2)：以所述DNA为模板，使用如本专利技术技术方案之一所述的引物组合进行特异性PCR扩增。
[0036]步骤(3)：对步骤(2)中获得的PCR扩增产物进行分离、克隆、测序和比对分析，获得所述样品中硫酸软骨素生物来源的信息。
[0037]在本专利技术的优选实施方案中，所述步骤(3)中的克隆为利用TA克隆的方法克隆所述步骤(2)中获得的PCR扩增产物。
[0038]在本专利技术的优选实施方案中，参考GBT21104
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2007从硫酸软骨素中提取DNA。
[0039]PEP
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PCR是一种全基因组扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合包括至少一引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物选自如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列中的一种或多种；所述下游引物选自如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列中的一种或多种。2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包含以下一对或多对引物对：上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:1，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:2；和/或，上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:3，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:4；和/或，上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:5，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:6；和/或，上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:7，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:8；和/或，上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:9，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:10。3.如权利要求2所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合由以下引物对组成：上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:1，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:2；上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:3，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:4；上游引物的核苷酸为SEQ ID NO:5，下游引物的核苷酸为SEQ ID NO:6；上游引物的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆峰，赖志华，杨升平，董婷婷，白雪冬，
申请(专利权)人：上海辉文生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：