一种基于PCR-CRISPR/Cas13a的梅毒螺旋体检测方法技术

本发明专利技术公开一种基于PCR

【技术实现步骤摘要】
一种基于PCR
‑
CRISPR/Cas13a的梅毒螺旋体检测方法


[0001]本专利技术涉及一种基于PCR
‑
CRISPR/Cas13a的梅毒螺旋体检测方法，特别涉及一种用于梅毒螺旋体检测，阿奇霉素耐药基因检测，以及基因分型的方法，属于分子诊断


技术介绍

[0002]梅毒是一种在世界范围内常见的性传播疾病，主要通过性接触、输血、创口或者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液播散全身，可使几乎所有的机体组织及器官受累，临床症状根据不同临床阶段，包括一期、二期、三期和潜伏期，临床表现多样且极具迷惑性，容易造成漏诊或误诊。实验室检测对梅毒诊断至关重要，但现有的基于核酸扩增的检测方法临床敏感性和特异性有限，并且由于梅毒螺旋体体外培养和金标准兔感染试验均不能在临床实践中常规开展，因此目前临床诊断主要依赖于血清学试验。然而，血清学实验仅对二期，三期梅毒具有较高敏感性，对一期梅毒的检测敏感性低下，无法对梅毒所有阶段进行有效的检测。近年，梅毒的发病率在全球范围内快速上升，如果能在检测出不同阶段的梅毒患者同时获取梅毒分子流行病学相关的信息(阿奇霉素耐药信息，分型的信息)，将有益于对梅毒螺旋体的进一步防治。同时，梅毒“血清固定”现象的存在，即经正规抗生素治疗后，血清学梅毒非特异性抗体仍呈阳性或滴度未能下降四倍，极大影响治疗效果的评估。因此，一种高敏感性的直接梅毒螺旋体检测方法对临床检测和疗效评估都具有极大的价值。
[0003]2017年美国的实验研究人员基于CRISPR/Cas13a技术开发了SHERLOCK(Specific HighSensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)检测平台，利用Cas13a的附属切割活性，结合RPA(Recombinase Polymerase Amplification)等温扩增技术，通过模板的两次放大实现了单拷贝级别的检测。由于SHERLOCK良好的可移植性与优秀的性能，大量基于此方案的检测平台被开发出来。但是RPA对于靶标的扩增会受到靶标序列的复杂程度的影响，比如GC含量，复杂的二级结构等，具有一定的局限性。PCR相对于这种等温扩增技术，能够更加灵活的针对不同的模板进行设计与扩增，大大增加可应用的范围。
[0004]目前，还没有基于PCR
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CRISPR/Cas13a在梅毒诊断方面的相关报道。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种基于PCR
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CRISPR/Cas13a的梅毒螺旋体检测试剂盒。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种基于PCR
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CRISPR/Cas13a的梅毒螺旋体检测方法。该方法是一种具有高敏感性、高特异性的基于PCR
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CRISPR/Cas13a的针对梅毒螺旋体的检测、耐药基因识别、基因分型的分子检测方法。
[0007]本专利技术通过将PCR与CRISPR/Cas13a结合，实现能够针对不同模板的具有高敏感性与特异性的体外检测技术。根据梅毒螺旋体的tpp47，23S rRNA，TP0548基因分别设计了对
应的PCR扩增引物与crRNA实现实现梅毒螺旋体的检测，阿奇霉素耐药基因的识别，分子流行病学的基因分型。这套便捷、快速、性能优异的分子诊断工具能够实现对梅毒的检测、分子流行病检测和治疗药物选择建议上提供具有价值的应用。
[0008]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0009]一种基于PCR
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CRISPR/Cas13a的梅毒螺旋体检测试剂盒，包括Cas13a、梅毒螺旋体检测引物F1/R1、梅毒螺旋体检测crRNA、报告RNA；
[0010]或者，包括Cas13a、梅毒螺旋体耐药识别引物F3/R3、梅毒螺旋体耐药识别crRNA1、报告RNA；
[0011]或者，包括Cas13a、梅毒螺旋体分型引物F4/R4、梅毒螺旋体分型crRNA
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Nichols、梅毒螺旋体分型crRNA
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SS14、报告RNA；
[0012]优选的，所述试剂盒还包括Tris
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HCl、rNTPs、RNA酶抑制剂、T7 RNA聚合酶、MgCl2。
[0013]优选的，所述的Cas13a为LwCas13a。
[0014]进一步的，
[0015]用于检测梅毒螺旋体的检测靶点为tpp47基因；设计的引物对为梅毒螺旋体检测引物F1/R1，设计的crRNA为梅毒螺旋体检测crRNA；
[0016]梅毒螺旋体检测引物F1：5
′‑
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTACCCACCGTGTCTACCACAA
‑3′
；
[0017]梅毒螺旋体检测引物R1：5
′‑
CAGTTGCGGTTCCTCATGAAT
‑3′
；
[0018]梅毒螺旋体检测crRNA：5
′‑
GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACTAAGACAATGCTCACTGAGGATAGTTTT
‑3′
；
[0019]所述的梅毒螺旋体检测引物F1/R1，用于扩增出能够进一步通过T7 RNA聚合酶转录出含有与梅毒螺旋体检测crRNA互补的RNA核酸片段的DNA核酸片段。
[0020]用于检测梅毒螺旋体耐药识别的检测靶点为23S rRNA基因；设计的引物对为梅毒螺旋体耐药识别引物F3/R3，设计的crRNA为梅毒螺旋体耐药识别crRNA1；进行梅毒螺旋体阿奇霉素耐药位点A2058G与A2059G点突变的识别。
[0021]梅毒螺旋体耐药识别引物F3：5
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GAAATTAATACGACTCACTATAGGGACGCGAGACTCGGTGAAATTTATGTACCGG
‑3′
；
[0022]梅毒螺旋体耐药识别引物R3：5
′‑
TCCCACCTATACTACACATGGTAAACCAAGT
‑3′
；
[0023]梅毒螺旋体耐药识别crRNA1：5
′‑
GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGTCTCCCCGTCTAACTATGGGTAACC
‑3′
；
[0024]所述的梅毒螺旋体检测引物F3/R3，用于扩增出能够进一步通过T7 RNA聚合酶转录出含有与梅毒螺旋体耐药识别crRNA1互补的RNA核酸片段的DNA核酸片段。
[0025]用于检测梅毒螺旋体分型的检测靶点为TP0548基因；设计的引物对为梅毒螺旋体分型引物F4/R4，设计的crRNA为梅毒螺旋体分型crRNA
‑
Nichols和梅毒螺旋体分型crRNA...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于PCR
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CRISPR/Cas13a的梅毒螺旋体检测试剂盒，其特征在于：包括Cas13a、梅毒螺旋体检测引物F1/R1、梅毒螺旋体检测crRNA、报告RNA；梅毒螺旋体检测引物F1：5
′‑
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTACCCACCGTGTCTACCACAA
‑3′
；梅毒螺旋体检测引物R1：5
′‑
CAGTTGCGGTTCCTCATGAAT
‑3′
；梅毒螺旋体检测crRNA：5
′‑
GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACTAAGACAATGCTCACTGAGGATAGTTTT
‑3′
；或者，包括Cas13a、梅毒螺旋体耐药识别引物F3/R3、梅毒螺旋体耐药识别crRNA1、报告RNA；梅毒螺旋体耐药识别引物F3：5
′‑
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGACGCGAGACTCGGTGAAATTTATGTACCGG
‑3′
；梅毒螺旋体耐药识别引物R3：5
′‑
TCCCACCTATACTACACATGGTAAACCAAGT
‑3′
；梅毒螺旋体耐药识别crRNA1：5
′‑
GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGTCTCCCCGTCTAACTATGGGTAACC
‑3′
；或者，包括Cas13a、梅毒螺旋体分型引物F4/R4、梅毒螺旋体分型crRNA
‑
Nichols、梅毒螺旋体分型crRNA
‑
SS14、报告RNA；梅毒螺旋体分型引物F4：5
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GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCAAAGAACTTTGGCTCAAATGAGCCGAAC
‑3′
；梅毒螺旋体分型引物R4：5
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GCAGCCCGAGACTGAACAAAAACGCATACA
‑3′
；梅毒螺旋体分型crRNA
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Nichols：5
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GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGTGTTCGACTTGGCAACTGTTTGTTT
‑3′
；梅毒螺旋体分型crRNA
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SS14：5
′‑
GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGTTTGACGTCGCTATCCTTTGTTTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑和平，陈文韬，罗豪，
申请(专利权)人：南方医科大学皮肤病医院广东省皮肤病医院，广东省皮肤性病防治中心，中国麻风防治研究中心，
类型：发明
国别省市：