一种检测禾谷孢囊线虫的RPA引物和探针、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测禾谷孢囊线虫的RPA引物和探针、试剂盒及应用，属于植物寄生线虫的检测领域。所述RPA引物和探针，其包括一对特异性引物HaRPA

【技术实现步骤摘要】
一种检测禾谷孢囊线虫的RPA引物和探针、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及植物寄生线虫的检测领域，特别是涉及一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的RPA的引物和探针、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]禾谷类作物孢囊线虫(Cereal cyst nematodes)是严重影响小麦、大麦、燕麦等禾谷作物的一大类孢囊线虫，在世界主要小麦产区都有发生分布和危害，造成小麦的重大产量损失，其中最为严重的是禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)、菲利普孢囊线虫(Heterodera filipjevi)和麦类孢囊线虫(Heterodera latipons)。
[0003]孢囊线虫的形态学差异非常小，主要在于孢囊阴门锥的结构，同时孢囊颜色、囊泡，双膜孔的形状也有细微的差异，但是这些差异需要丰富的专业知识才能够区分，在生产实际中很难应用，同时传统的形态学鉴定耗时较多，工作量大，很难满足目前高效快速和轻简化检测的要求。近年来，随着分子生物学的快速发展，PCR等快速检测技术已经广泛的运用到植物线虫的快速检测和鉴定中。目前运用到孢囊线虫的检测技术主要包括ITS
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RFLP，PCR，SCAR，RAPD，real time PCR等。在早期，限制性片段长度多态性(RFLP)主要用于区分H.avenae和H.filipjevi，但是禾谷孢囊线虫的核糖体DNA(rDNA)中的ITS(内转录间隔区)显示了种内群体的异质性和遗传多样性。Qi等(2012)和Peng等(2013)分别筛选出H.avenae和H.filipjevi的SCAR标记引物，可以直接从土壤和小麦根部检测出H.avenae和H.filipjevi。Toumi(2012)等人根据线粒体DNA(mtDNA)的COI序列设计了特异性引物，分别检测多个国家和地区的H.avenae和H.filipjevi。彭德良等(2003)扩增了中国小麦禾谷孢囊线虫群体的核糖体基因的内转录间隔区，用AluI和RsaI酶切ITS扩增产物证明中国禾谷孢囊线虫ITS属于“B型”，Hinf I酶切揭示出中国与摩洛哥禾谷孢囊线虫ITS之间存在明显差异。Yan等(2011)运用rDNA
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ITS区域RFLP结合形态学鉴定的方法对美国部分地区的禾谷孢囊线虫进行了检测，该方法通过6种限制性内切酶能够有效的区分禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫。Fu等对中国黄淮海麦区的禾谷孢囊线虫进行了ITS和RFLP分析。以PCR为基础的分子鉴定方法一定程度上弥补了传统形态鉴定上的缺陷。但PCR检测需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统(紫外仪)等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，以上检测只能在实验室条件下才可以检测，需要较长的时间，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用，在禾谷孢囊线虫病发生分布调查和田间快速诊断过程中，迫切需要一种简便快捷的检测手段。
[0004]上述方法综合特点是反应时间长，操作复杂，需要昂贵的设备。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplificarion，RPA)更是被称为可替代PCR的核酸检测技术。RPA技术是模拟了生物体内DNA复制，基于重组酶和聚合酶介导的扩增原理发展而来。该技术主要依赖于结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。这3种酶的混合物在常温下即具有活性，最佳反应温度在37℃
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42℃。目前，虽然已有研究者将该方法应用到植物寄生线虫的检测上，但是使用RPA技术检测土壤中
禾谷孢囊线虫的研究还未见报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种检测禾谷孢囊线虫的RPA引物和探针、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过设计特异性检测禾谷孢囊线虫的RPA引物和探针，可以检测目标线虫，并且操作步骤简单，反应结果能够通过肉眼直接判定，适用于各种条件下检测工作的进行。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的RPA引物和探针，其特征在于，包括一对特异性引物HaRPA
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F3和HaRPA
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R3，以及一个探针Ha
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probe，其中，所述HaRPA
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F3和HaRPA
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R3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1
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2所示，所述Ha
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probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0008]优选的是，所述HaRPA
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R3的5'末端标记生物素。
[0009]优选的是，所述Ha
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probe的5'末端标记荧光基团，所述Ha
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probe的5'末端和3'末端的中间加入一个四氢呋喃，3'末端标记修饰胺基、磷酸基基团或C3
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Spacer亚磷酰胺。
[0010]本专利技术还提供一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的试剂盒，包括所述的RPA引物和探针。
[0011]本专利技术还提供一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的方法，包括以待测样品中提取的DNA为模板，利用所述的RPA引物和探针扩增，电泳检测或侧流层析试纸条检测判定是否含有禾谷孢囊线虫H.avenae。
[0012]优选的是，扩增反应体系为A buffer 29.4μL，引物HaRPA
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F3和HaRPA
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R3各2μL，探针Ha
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probe 0.6μL，模板DNA 2μL，11.5μL dd H2O，2.5μL B buffer；
[0013]扩增条件为：40℃保温12min，4℃保存。
[0014]优选的是，采用侧流层析试纸条检测时，若所述试纸条的质控线和检测线全部出现条带，则所述待测样品为或含有禾谷孢囊线虫；若所述试纸条的质控线出现条带且检测线不出现条带，则所述待测样品不为或不含有禾谷孢囊线虫。
[0015]本专利技术还提供所述的RPA引物和探针，或所述的方法在制备检测禾谷孢囊线虫H.avenae试剂盒中的应用。
[0016]本专利技术还提供所述的RPA引物和探针，或所述的方法在制备诊断禾谷孢囊线虫感染情况的试剂盒中的应用。
[0017]优选的是，所述试剂盒中包括凝胶电泳相关试剂或侧流层析试纸条。
[0018]本专利技术公开了以下技术效果：
[0019]本专利技术利用RPA技术，获得了基于禾谷孢囊线虫基因组DNA的特异性序列设计出其特异性引物和探针，检测出目标线虫。利用设计上述的特异性引物和探针建立的禾谷孢囊线虫检测方法灵敏度高，特异性非常强，灵敏度结果显示RPA检测方法的检测阈值为10
‑3个二龄幼虫DNA，10
‑4个单孢囊DNA和0.01ng基因组DNA，灵敏度是普通PCR检测的100倍。与常见的密切相关的植物寄生线虫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的RPA引物和探针，其特征在于，包括一对特异性引物HaRPA
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F3和HaRPA
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R3，以及一个探针Ha
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probe，其中，所述HaRPA
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F3和HaRPA
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R3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1
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2所示，所述Ha
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probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。2.根据权利要求1所述的RPA引物和探针，其特征在于，所述HaRPA
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R3的5'末端标记生物素。3.根据权利要求1所述的RPA引物和探针，其特征在于，所述Ha
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probe的5'末端标记荧光基团，所述Ha
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probe的5'末端和3'末端的中间加入一个四氢呋喃，3'末端标记修饰胺基、磷酸基基团或C3
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Spacer亚磷酰胺。4.一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1
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3任一项所述的RPA引物和探针。5.一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的方法，其特征在于，包括以待测样品中提取的DNA为模板，利用权利要求1

【专利技术属性】
技术研发人员：彭焕，彭德良，邵蝴蝶，黄文坤，孔令安，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：