一种快速检测鳞球茎线虫的引物、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种快速检测鳞球茎线虫的引物、试剂盒及应用，属于植物线虫分子检测技术领域。所述引物为特异性引物Dp

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测鳞球茎线虫的引物、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及植物线虫分子检测
，特别是涉及一种快速检测鳞球茎线虫的引物、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]鳞球茎茎线虫(拉丁名为Ditylenchus dipsaci(Kuhn,1987)Filijev)又称起绒草茎线虫，作为一种破坏性寄生线虫，拥有近500多种寄主种类，主要为害部位是茎组织，也对块状茎、鳞茎、球茎以及根状茎等部位有很大危害。该线虫的为害能造成很多农作物的减产，更严重者，能造成植株坏死。20年代，鳞球茎茎线虫使英国水仙种植业几乎毁灭，据报道在水仙上一个生长季节鳞球茎茎线虫可以增15000倍，能使整个鳞茎迅速毁坏。此外，鳞球茎茎线虫严重危害甜菜，并在寄主内大量繁殖，逐渐形成腐烂病，导致贮藏根系数腐坏。少量的鳞球茎茎线虫也能造成极大危害。研究表明，如果有每500g土壤1条线虫的存活量，该线虫即能造成洋葱等植株的减产。一旦其存在于土壤中，即可大量繁殖，非常难以根除。
[0003]在茎线虫的分子检测中，Wendt等(1993)开发了ITS
‑
RFLP的技术，利用多种限制性内切酶酶切ITS序列，能够准确的区分马铃薯腐烂茎线虫和鳞球茎线虫。本专利技术申请人在前期的研究(宛菲等，2008)中发现，马铃薯腐烂茎线虫的ITS具有明显差异，可以分为明显的2种类型，A型和B型，据此设计出2对特异性引物检测A型和B型，A型鳞球茎线虫特异引物为DDS1/DDS2，特异扩增片段为252bp；B型鳞球茎线虫特异引物为DDL1/DDL2，特异扩增片段为485bp；引入线虫通用引物D3A/D3B作内标，研究出一步双重PCR特异性检测鳞球茎线虫不同类型群体的分子技术和方法，该分子检测技术具有特异性强、方法可靠、灵敏性高、操作简便，检测的精确度达到单条线虫的水平。Marek等(2010)等根据D.destructor和D.dipsaci的差异开发出能够同时检测上述两种线虫的特异性引物DipU
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F/DipU
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R，Des2
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F/Des1
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R，其中DipU
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F/DipU
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R能够特异的从D.dipsaci检测出333bp的片段，Des2
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F/Des1
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R能够特意的从马铃薯腐烂茎线虫中检测出453bp的片段。刘斌等(2007)根据马铃薯腐烂茎线虫的ITS序列设计了一组特异性引物，能够扩增出346bp的片段，但是检测的样本只包括了腐烂茎线虫。Esquibet et al.(2003)和Zouhar et al.(2007)分别开发出鳞球茎线虫的SCAR
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PCR检测技术，扩增的片段分别为242bp和325bp。
[0004]近些年，在我国海关口岸连续从美国、加拿大、日本和西班牙等国家进口的大蒜、洋水仙种球、郁金香种球上截获过大量的鳞球茎线虫，但对于快速检测引物的开发，国内暂无报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种快速检测鳞球茎线虫的引物、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，能特异性检测鳞球茎线虫，为鳞球茎线虫快速PCR早期诊断和辅助鉴定等服务。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种快速检测鳞球茎线虫的引物，所述引物为特异性引物Dp
‑
482F和Dp
‑
829R，其核苷酸序列如下：
[0008]Dp
‑
482F:5
’‑
GCTGCGTTGAAGAGAACTGGCAC
‑3’
，
[0009]Dp
‑
829R:5
’‑
CGGAAAAGCACCCAACCAGTACC
‑3’
。
[0010]本专利技术还提供一种快速检测鳞球茎线虫的产品，包括所述的引物。
[0011]优选的是，所述产品包括试剂盒、试剂。
[0012]本专利技术还提供一种快速检测鳞球茎线虫的方法，包括利用所述的引物扩增待测样品目的基因片段的步骤。
[0013]优选的是，扩增的反应体系为：10
×
PCR Buffer 2.5μL，10mM dNTP 2μL，Taq酶0.5μL，引物Dp
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482F和Dp
‑
829R各1.0μL，DNA模板1μL，无菌蒸馏水补充至25μL。
[0014]优选的是，扩增条件为：94℃，5min；94℃,30s，56℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min；4℃保存。
[0015]本专利技术还提供一种所述的引物在制备检测鳞球茎线虫试剂或者试剂盒中的应用。
[0016]本专利技术公开了以下技术效果：
[0017]本专利技术采用通用引物rDNA1和rDNA2扩增出鳞球茎线虫的ITS序列，通过和其他茎线虫的ITS序列比对和PCR检测，设计筛选出一对特异性引物Dp
‑
482F和Dp
‑
829R，并开发出鳞球茎线虫特异性的检测方法，实现了对鳞球茎线虫的检测。采用特异性引物Dp
‑
482F和Dp
‑
829R能够特异检测7个不同地理种群的鳞球茎线虫，扩增片段均为327bp，而其他7类茎线虫属13个种群均扩增到片段。为了降低检测的假阴性结果，在特异性检测的同时加入28s的通用引物D2A和D3B，用于DNA的检测，通用引物D2A和D3B能够从所有的有效的DNA中扩增出长度为780bp左右的片段，阳性的样本将同时出现了327bp的特异性片段和780bp的片段，而非鳞球茎线虫只有780bp的片段，从而降低了误检的可能。同时，通过特异性引物的灵敏度检测，显示鳞球茎线虫的特异性引物和检测方法的检测阈值分别为10ng/μL和1/128头线虫，具有很高的灵敏度。因此，本专利技术具有极高的特异性和灵敏度，能够快速对鳞球茎线虫进行分子诊断。该方法将可以应用于鳞球茎线虫的田间样品检测和发生分布的监测、预警，具有重要的实际的应用价值。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019]图1为本专利技术鳞球茎线虫与其他近源种的ITS序列比对及特异性引物设计；
[0020]图2为本专利技术不同引物扩增结果；M为标准DNA分子标记(DNA marker 2000)；1～10分别为10组不同的引物的PCR扩增结果；CK为阴性对照；
[0021]图3为本专利技术鳞球茎线虫特异性检测结果；M为标准DNA分子标记(DNA marker III)；1～7分别为腐烂茎线虫不同群体(编码为1～7)；8～1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测鳞球茎线虫的引物，其特征在于，所述引物为特异性引物Dp
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482F和Dp
‑
829R，其核苷酸序列如下：Dp
‑
482F:5
’‑
GCTGCGTTGAAGAGAACTGGCAC
‑3’
，Dp
‑
829R:5
’‑
CGGAAAAGCACCCAACCAGTACC
‑3’
。2.一种快速检测鳞球茎线虫的产品，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒、试剂。4.一种快速检测鳞球茎线...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭焕，彭德良，刘恩良，黄文坤，李英梅，常青，
申请(专利权)人：陕西省生物农业研究所，
类型：发明
国别省市：