修饰的PIGGYBAC转座酶多肽、编码它们的多核苷酸、引入载体、试剂盒、将靶序列整合到细胞基因组中的方法以及生产细胞的方法技术

一般而言，根据一个实施方案，修饰的piggyBac转座酶多肽包括piggyBac转座酶氨基酸序列和核定位信号氨基酸序列。酸序列和核定位信号氨基酸序列。酸序列和核定位信号氨基酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的PIGGYBAC转座酶多肽、编码它们的多核苷酸、引入载体、试剂盒、将靶序列整合到细胞基因组中的方法以及生产细胞的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请基于并要求2020年6月10日提交的日本专利申请第2020
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101013号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
[0003]领域
[0004]本专利技术的实施方案涉及修饰的piggyBac转座酶多肽、编码它们的多核苷酸、引入载体、试剂盒、将靶序列整合到细胞基因组中的方法以及生产细胞的方法。
[0005]背景
[0006]转座子法作为将靶序列整合到细胞基因组中的方法受到关注。在转座子方法中，使用一种称为转座酶的酶。转座酶具有切除两端具有识别序列的靶序列并将该靶序列插入基因组的功能。例如，蛾衍生的piggyBac转座酶是已知的。
[0007]将靶序列整合到细胞基因组中的技术已应用于各种领域，例如转基因细胞、转基因动物的生产、基因治疗和再生医学。因此，对整合技术的效率和简化的需求日益增加。
[0008]附图简要说明
[0009]图1是示例第一实施方案的修饰的piggyBac转座酶的实例的图。
[0010]图2是示例实施方案的将靶序列整合到细胞基因组中的方法的实例的流程图。
[0011]图3是示例实施方案的供体DNA的实例的图。
[0012]图4也是示例使用实施方案的修饰的piggyBac转座酶将靶序列整合到细胞基因组中的过程的实例的示意图。
[0013]图5是示例实施方案的各引入载体的实例的剖视图。
[0014]图6是示例第二实施方案的修饰的piggyBac转座酶的实例的图。
[0015]图7是示例实施例5的实验结果的图表。
[0016]图8是示例实施例6的实验结果的图表。
[0017]图9是示例实施例7的实验结果的图表。
[0018]图10是示例实施例8的实验结果的图表。
[0019]实施方案的说明
[0020]一般而言，根据一个实施方案，修饰的piggyBac转座酶多肽包括piggyBac转座酶氨基酸序列和核定位信号氨基酸序列。
[0021]在下文中，将参照附图描述实施方案。注意，在各实施方案中，对实质上相同的成分标注相同的附图标记，并省略其部分说明。附图为示意图，各部分的厚度与平面尺寸之间的关系、各部分的厚度比例等可能与实际有所不同。
[0022]根据实施方案，提供了修饰的piggyBac转座酶。当本文简称为“修饰的piggyBac转座酶”时，它指的是修饰的piggyBac转座酶多肽的形式。根据另一个实施方案，还可以提供编码修饰的piggyBac转座酶的多核苷酸。
[0023]实施方案的修饰的piggyBac转座酶可用于例如将靶序列整合到细胞基因组中。因
此，根据进一步的实施方案，还提供了使用修饰的piggyBac转座酶将靶序列整合到细胞基因组中的方法、其中使用的试剂盒以及生产细胞的方法。在下文中，将描述每个实施方案。
[0024](第一实施方案)
[0025]‑
修饰的piggyBac转座酶
[0026]如图1所示，第一实施方案的修饰的piggyBac转座酶1包括核定位信号结构域2和piggyBac转座酶结构域3。在下文中，将核定位信号结构域2也称为“NLS结构域”，将piggyBac转座酶结构域3也称为“PB结构域”。
[0027]PB结构域3是包含piggyBac转座酶氨基酸序列的结构域。piggyBac转座酶是指来源于作为蛾类的毛毛虫(Trichoplushia ni)的转座酶或其衍生物。例如，可以使用表1所示的野生型piggyBac转座酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)作为PB结构域3。
[0028]表1：野生型piggyBac转座酶(SEQ ID NO:1)
[0029][0030]或者，PB结构域3的序列不限于上述序列，并且例如，也可以使用具有表1所示的序列中包含的氨基酸的置换、添加、插入、缺失等突变的衍生物。例如，优选使用与表1所示的序列具有90％以上的氨基酸序列同源性的衍生物。也可以使用表2所示的序列(SEQ ID NO:2)，其为野生型piggyBac转座酶的衍生物。SEQ ID NO:2是优选的，因为它具有加下划线的来自SEQ ID NO:1的七个氨基酸置换并且具有更高的转座酶活性。
[0031]表2：氨基酸序列
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修饰的piggyBac转座酶(SEQ ID NO:2)
[0032][0033]NLS结构域2是包括核定位信号(NLS)氨基酸序列的结构域。任何已知的NLS多肽都可以用作NLS结构域2。NLS可以是经典的NLS或非经典的NLS。
[0034]例如，可以使用表3中所示的猿猴病毒40(SV40)的大T抗原蛋白的NLS(SEQ ID NO:3)作为经典的NLS。
[0035]表3：SV40的大T抗原蛋白的NLS(SEQ ID NO:3)
[0036]KKKRKV
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ6[0037]或者，可以使用核质蛋白、性别决定区Y(SRY)的NLS等作为典型的NLS。
[0038]例如，可以使用表4中所示的人免疫缺陷病毒(HIV)的转录反式激活因子(TAT)蛋白(SEQ ID NO:4)作为非经典的NLS。
[0039]表4：HIV的TAT蛋白(SEQ ID NO:4)
[0040]GRKKRRQRRR
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10
[0041]或者，可以使用博尔纳病病毒(BDV)p10、磷脂加扰酶1(PLSCR1)、Ty1整合酶、HIV
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1Rev、人T细胞白血病1型(HTLV
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1)Rex、Ste12、Pho4或Yap1等作为非经典的NLS。
[0042]可以单独使用上述NLS之一作为NLS结构域2，或可以将相同或不同类型的多个NLS连接并用作NLS结构域2。例如可以将经典的NLS和非经典的NLS连接并用作NLS结构域2。优选使用如下的序列作为NLS结构域：其中HIV的TAT蛋白和SV40的大T抗原蛋白的NLS从N端开始按该顺序连接。
[0043]例如，NLS结构域2和PB结构域3优选从N端侧开始按该顺序连接，但也可以按照PB结构域3、NLS结构域2的顺序连接。
[0044]如在本说明书中使用的，术语“连接”是指各结构域以这样的状态结合：其中这些结构域可以执行它们的功能。此外，术语“连接”包括直接结合的状态和通过不同顺序结合的状态。不同的序列可以是对每个结构域的功能没有不利影响的氨基酸或多肽。例如，不同的序列优选为各结构域所衍生的生物体基因组中的结构域周围的序列、GGGGS序列或GS序列、或将这些序列重复1至5次而得到的序列。
[0045](编码修饰的piggyBac转座酶的多核苷酸)
[0046]根据另一个实施方案，提供了编码修饰的pig本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.修饰的piggyBac转座酶多肽，其包含：piggyBac转座酶氨基酸序列；和核定位信号氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述piggyBac转座酶氨基酸序列具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列和SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述核定位信号氨基酸序列是其中人免疫缺陷病毒(HIV)的TAT(转录反式激活因子)蛋白的核定位信号与猿猴病毒40(SV40)的大T抗原蛋白的核定位信号相连接的肽。4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述核定位信号氨基酸序列是其中SEQ ID NO:4的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相连接的肽。5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其进一步包含促进细胞分裂的肽的氨基酸序列。6.根据权利要求5所述的多肽，其中所述促进细胞分裂的肽的氨基酸序列具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列。7.编码修饰的piggyBac转座酶的多核苷酸，其包含：编码piggyBac转座酶的碱基序列；和编码核定位信号的碱基序列。8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA或RNA。9.根据权利要求7或8所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA并且所述编码piggyBac转座酶的碱基序列具有SEQ ID NO:5的序列。10.根据权利要求7至9中任一项所述的多核苷酸，其中与构成所述修饰的piggyBac转座酶的氨基酸相对应的密码子中的至少一个密码子针对人进行了优化。11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中“针对人进行了优化”是针对下述每个氨基酸使用以下密码子：丙氨酸(A)的密码子为GCU或GCC；半胱氨酸(C)的密码子为UGC或UGU；天冬氨酸(D)的密码子为GAC或GAU；谷氨酸(E)的密码子为GAA或GAG；苯丙氨酸(F)的密码子为UUC或UUU；甘氨酸(G)的密码子为GGA或GGC；组氨酸(H)的密码子为CAC或CAU；异亮氨酸(I)的密码子为AUC或AUU；赖氨酸(K)的密码子为AAA或AAG；亮氨酸(L)的密码子为CUC或CUG；甲硫氨酸(M)的密码子为AUG；天冬酰胺(N)的密码子为AAC或AAU；脯氨酸(P)的密码子为CCC或CCU；谷氨酰胺(Q)的密码子为CAA或CAG；精氨酸(R)的密码子为AGA或AGG；
丝氨酸(S)的密码子为AGC、UCC或UCU；苏氨酸(U)的密码子为ACA或ACC；缬氨酸(V)的密码子为GUC或GUG；色氨酸(W)的密码子为UGG；酪氨酸(Y)的密码子为UAC或UAU；和终止子的密码子为UGA；其中A是腺嘌呤，U是尿嘧啶，C是胸腺嘧啶，G是鸟嘌呤，并且当所述多核苷酸是DNA时，U变为胸腺嘧啶(T)。12.根据权利要求7至11中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA并且所述编码piggyBac转座酶的碱基序列具有SEQ ID NO:6或7的序列。13.根据权利要求7至12中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA并且所述编码核定位信号的碱基序列具有SEQ ID NO:8、9或10的序列。14.根据权利要求7至13中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:17或18的碱基序列。15.根据权利要求7至14中任一项所述的多核苷酸，其进一步包含编码促进细胞分裂的肽的碱基序列。16.根据权利要求15所述的多核苷酸，其中所述多肽是DNA，并且...

【专利技术属性】
技术研发人员：赤星英一，野崎绘美，石原美津子，
申请(专利权)人：株式会社东芝，
类型：发明
国别省市：