一种黄素单加氧酶突变体及其制备和应用制造技术

本发明专利技术属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种酶活性提升的黄素单加氧酶突变体及其制备与应用。通过全基因合成来自大蒜(Allium sativum)的野生型黄素单加氧酶基因，利用易错PCR技术对野生型黄素单加氧酶基因进行随机突变，得到黄素单加氧酶突变体N91G，及其编码基因asfmom，重新构建重组质粒，并实现了其在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得活性进一步提高的黄素单加氧酶。取等技术获得活性进一步提高的黄素单加氧酶。取等技术获得活性进一步提高的黄素单加氧酶。

【技术实现步骤摘要】
一种黄素单加氧酶突变体及其制备和应用

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[0001]本专利技术属于酶的基因工程
，具体涉及一种酶活性提升的黄素单加氧酶突变体及其制备与应用。

技术介绍
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[0002]黄素单加氧酶(Flavin
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containing monooxygenase,FMO,EC 1.14.13.8)，是一种能在C、N和S原子上加氧的酶，催化氧气的一个氧原子与电子供体提供的氢原子结合生成水，另外一个氧原子插入有机底物，形成新的产物，这一反应严格依赖于辅因子。蒜氨酸，是大蒜中独有的含硫化合物，可作为天然防腐剂，对各种真菌的杀灭作用强度与化学防腐剂苯甲酸、山梨酸相近似；具有抗氧化和清除自由基的活性，可以延缓衰老；同时具有抗菌杀毒、抗肿瘤、协同降血压等重要的药理功效。因此，可以利用黄素单加氧酶催化脱氧蒜氨酸制备具有多种生物活性功能的蒜氨酸，这些酶法合成的蒜氨酸可应用于食品防腐剂、食品调味料、保健食品、药物等，具有极大的利用价值和应用前景。
[0003]目前，人们主要通过提取法和化学合成法获得蒜氨酸，酶法合成使用较少。然而，酶法合成因其安全、高效和高产等特点，逐渐受到关注。酶法合成优势主要在于以下几点：首先酶法合成比化学法合成更安全和绿色，成本更低；其次，提取法效率低，提取过程由于蒜氨酸与蒜氨酸酶反应，产生大量蒜素，从而降低了蒜氨酸的品质；酶法合成蒜氨酸，利用了微生物生长繁殖快，易于控制等特点，可以按照意愿大量合成蒜氨酸。
[0004]黄素单加氧酶的应用严格受限于其活性、专一性、最适温度和pH值、温度和酸碱稳定性、溶剂耐受性等酶学性质。因此，需要不断提高酶的活性，获得高产的蒜氨酸，从而实现蒜氨酸的工业化生产。然而，已报道的能催化脱氧蒜氨酸生成蒜氨酸的黄素单加氧酶极少，而且催化效率和转化率较低。在实际生产过程中，酶活性低不仅限制了其应用范围，还增加了工业应用成本，为实际应用带来困难。因此，筛选到高活性的黄素单加氧酶具有重要研究意义。为了解决这些实际应用问题，研究者通过蛋白质工程技术来改善天然酶的功能及特征，以满足工业上的应用，例如定向进化、理性设计、化学修饰等。
[0005]定向进化是改善酶的功能和特性的重要手段之一，尤其在提高酶的催化活性方面。它属于蛋白质的非理性设计，不需要获得蛋白质的高级结构以及催化位点等信息，只需对蛋白质氨基酸序列做随机突变。它可以在实验室里模拟自然选择的进化机制，通过分子生物学手段在体外快速建立含大量目的蛋白编码基因的突变体文库，并通过高通量的定向筛选方法，快速获得符合人类应用价值的蛋白质突变体。定向进化的核心步骤主要包括构建具有多样性的突变体文库和高通量的筛选方法。常用的包括：易错PCR、饱和突变、DNA改组、交错延伸PCR等。定点突变，即理性设计，在蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等基础上，有的放矢对其进行改造，且只能对天然酶蛋白质中的少数氨基酸进行替换、删除或插入，不改变酶蛋白的高级结构，对酶功能和特性的改造有限。因此，对于结构与功能未知的酶，定向进化可在一定程度上弥补理性设计的不足。
[0006]大肠杆菌外源基因表达系统是目前研究得最深入、发展也最完善的表达系统，许
多有价值的多肽和蛋白质已在大肠杆菌中实现了高效表达。它已作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛地应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研领域。
[0007]酵母表达系统兼有原核和高等真核系统的优点，具备培养条件普通、生长速度快、成本相对较低、能进行蛋白翻译后加工、易获得可溶性活性重组蛋白等特点，被广泛用于重组蛋白尤其是真核蛋白的生产制备。其中毕赤酵母因其生长速度快、商业化表达载体丰富、可获得高效的分泌表达等优点，使其成为酵母表达重组蛋白的优先选择。它与常用的大肠杆菌表达系统相比有着独特的优势，即可将目的基因表达的产物分泌到胞外，从而降低进一步收集、分离、纯化基因表达产物的成本和工作量。随着分子生物学技术的发展和毕赤酵母研究的深入，使用毕赤酵母表达系统已经克隆和表达了大量基因，有些已进行大规模工业生产，多种酶和临床需要的化学药品或者工业产品都通过毕赤酵母来表达生产。

技术实现思路
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[0008]基于现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种活性提升的新型黄素单加氧酶及其制备与应用。
[0009]实现本专利技术目的的技术路线概述如下：
[0010]通过全基因合成获得大蒜(Allium sativum)野生型黄素单加氧酶(AsFMO)编码基因，通过酶切、连接等构建重组载体之后，经测序获得野生型asfmo序列(如SEQ ID NO.2所示)，利用易错PCR技术对野生型AsFMO编码基因进行随机突变，利用大肠杆菌表达系统筛选得到AsFMO突变体N91G，及其编码基因asfmom，重新构建重组载体，并实现了其在大肠杆菌、毕赤酵母中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得活性提高的AsFMO突变体。
[0011]在本专利技术中采用如下定义：
[0012]1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法
[0013]使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
[0014]2.AsFMO突变体的标识
[0015]采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示AsFMO突变体中突变的氨基酸。如Asn91Gly(N91G)，表示位置91的氨基酸由野生型AsFMO的Asn替换成Gly，位置的编号对应于SEQ ID No.1中野生型AsFMO的氨基酸序列编号。
[0016]在本专利技术中，小写斜体asfmo表示野生型AsFMO的编码基因，小写斜体asfmom表示突变体N91G的编码基因，信息如下表。
[0017] 氨基酸突变位点基因突变位点氨基酸SEQ ID No.核苷酸SEQ ID No.野生型AsFMO——12突变体N91GAsn91GlyAAC
→
GGT34
[0018]所述的AsFMO突变体N91G及其编码基因的表达载体为pET
‑
28a或pPIC9K，宿主细胞可以为大肠杆菌BL21(DE3)或毕赤酵母GS115。
[0019]本专利技术的实验方案具体如下：
[0020]1、AsFMO突变体N91G编码基因的获得，包括如下步骤：
[0021](1)以大蒜野生型AsFMO编码基因asfmo(SEQ ID No.2)为模板进行易错PCR随机突
变；
[0022](2)将随机突变后的AsFMO编码基因，通过酶切、连接等与pET
‑
28a构建重组质粒后转入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选获得活性提升的AsFMO突变体，经测序获得AsFMO突变体编码基因asfmom，并将该突变体命名为突变体N91G，将含有突变体N91G编码基因asfmom的质粒pET
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28a
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asfmom及重组菌保存。
[0023]2、一株含有突变体N91G编码基因asfmom的毕赤酵母本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黄素单加氧酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。2.权利要求1所述黄素单加氧酶突变体的编码基因。3.权利要求2所述黄素单加氧酶突变体的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ ID No.4所示。4.一种包含权利要求2所述基因的重组载体或重组菌株。5.如权利要求4述的重组载...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凤华，刘逸寒，郭泽辉，路福平，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：