一种耐高温重组突变型SOD及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开的是一种耐高温重组突变型SOD及其编码基因和应用，以耐高温菌Acidilobus saccharovorans的SOD序列为基础，将其编码蛋白的氨基酸序列中164L突变为I以及168V突变为E，从而提高SOD的活性、热稳定性、耐酸碱性以及耐胰蛋白酶消化性，其活性至少提高60％以上，活性显著高于现有技术生产的SOD的活性，耐高温突重组变型SOD包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，还提供了在制备超氧化物歧化酶产品中的应用，特别是在医药、食品、化妆品等行业，本发明专利技术具有突变酶活显著提高，耐胰蛋白酶消化，具有较高蛋白稳定性，耐高温等技术特点。耐高温等技术特点。耐高温等技术特点。

【技术实现步骤摘要】
一种耐高温重组突变型SOD及其编码基因和应用


[0001]本专利技术涉及酶及其编码基因与应用，特别涉及一种耐高温重组突变型SOD及其编码基因和应用，属于生物基因工程领域。

技术介绍

[0002]超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢过程的酶。它广泛存在于各类动物、植物、微生物中，是一种重要的抗氧化剂，对细胞生命活动具有重大意义。超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不同可分为四类：Cu/Zn
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SOD、Mn
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SOD、Fe
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SOD和Ni
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SOD。
[0003]SOD不但能维持生物体内活性氧的产生与消除的动态平衡，并且能够有效抑制活性氧过多而引发的各种氧化损伤，对癌症、炎症、辐射损伤等均有一定的疗效，还可减少抗癌药物对细胞和心脏的毒副作用，是具有抗肿瘤活性的最有效的抗氧化酶之一，因此在保健品、医药、化妆品、食品、农业等领域中具有重要的应用价值。然而，在实际应用中SOD仍然存在一些不足，如热稳定性差，在高温下易失活；天然SOD分离纯化成本昂贵等。虽然目前的基础研究已经证明了SOD的功效和作用方式，但由于现有技术中的SOD在热稳定性、活性维持等方面存在缺陷，因此其极大地限制了SOD在化妆品、食品和医药、农业领域中的应用，不能很好地达到预期的效果。

技术实现思路

[0004]为解决现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种耐高温重组突变型SOD及其编码基因和应用，具有突变酶活显著提高，耐胰蛋白酶消化，具有较高蛋白稳定性，耐高温等技术特点。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的。
[0006]本专利技术一种耐高温重组突变型SOD，耐高温突重组变型SOD包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0007]本专利技术一种编码耐高温重组突变型SOD的核苷酸序列，包含编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列核苷酸序列。
[0008]优选的，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术一种重组表达载体，包含编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0010]本专利技术一种重组菌，包含上述重组表达载体。
[0011]本专利技术一种所述的耐高温重组突变型SOD的制备方法，包含以下步骤：培养上述所述的重组菌，从重组菌中得到超氧化物歧化酶。
[0012]本专利技术一种所述耐高温重组突变型SOD的纯化方法，包含以下步骤：
[0013]A：诱导表达所述的重组菌，菌液离心集菌后，超声破碎，收集破碎后上清；
[0014]B：上清利用镍柱亲和层析；
[0015]C：超滤脱盐，冻干保存。
[0016]优选的，所述耐高温重组突变型SOD的纯化方法，镍柱洗脱液咪唑浓度为500mmol/L。
[0017]所述SEQ ID NO.1序列，或编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或所述的重组表达载体，或所述的重组菌，或所述的耐高温重组突变型SOD的制备方法，在制备超氧化物歧化酶产品中的应用。
[0018]有益效果：
[0019]1、突变型SOD和未突变SOD酶活分别为1860U/mg、1130U/mg，因此，经过突变酶活显著提高。
[0020]2、本专利技术提供的耐高温突变型SOD，在pH 2
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10的条件下具有较高的稳定性。
[0021]3、本专利技术提供的耐高温突变型SOD，在pH 4
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10的条件下具有较高的活性，具有较强的耐酸碱性。
[0022]4、本专利技术提供的耐高温突变型SOD，经过60摄氏度处理后，活性提高，且是高温处理的最佳温度。
[0023]5、本专利技术提供的耐高温突变型SOD，能够耐胰蛋白酶消化，具有较高蛋白稳定性，可应用于口服，市场前景广阔。
附图说明
[0024]图1：扩增突变SOD基因双酶切图；
[0025]图2：扩增突变SOD基因与载体双酶切电泳图；
[0026]图3：菌落PCR扩增图；
[0027]图4：重组载体pET
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28a
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SOD的酶切鉴定图；
[0028]图5：耐高温突变型重组SOD蛋白的诱导表达和表达模式鉴定图；
[0029]图6：耐高温突变型重组SOD蛋白纯化图；
[0030]图7：耐高温突变型重组SOD与野生型SOD耐高温实验图；
[0031]图8：不同pH条件处理耐高温突变型重组SOD蛋白的酶活鉴定图；
[0032]图9：不同浓度的胰蛋白酶对耐高温重组突变型SOD蛋白的稳定性影响图。
[0033]图7中：不同pH条件处理耐高温突变型重组SOD蛋白的稳定性鉴定，M为maker，1为常温突变型SOD上清，2为常温野生型SOD上清，3为80℃处理30分钟后的突变型SOD上清，4为80℃处理30分钟后的野生型SOD上清，5为60℃处理30分钟后的突变型SOD上清，6为60℃处理30分钟后的野生型SOD上清。
具体实施方式
[0034]下面通过具体实施例并结合附图对本专利技术作进一步的详细说明。以下各实施例仅仅是用于说明而不是限制本专利技术。
[0035]本专利技术提供的耐高温突变型SOD及其编码基因，利用生物信息学方法，以耐高温菌Acidilobus saccharovorans的SOD序列为基础，将为164L突变为I、168V突变为E，从而提高SOD的活性、热稳定性、耐酸碱性以及耐胰蛋白酶消化性，其活性提高60％以上，且活性显著高于现有技术生产的SOD的活性，如专利文献CN201810105875.6记载的纯化耐高温SOD的比
活为1315U/mg；CN200510061502.6记载的大肠杆菌表达SOD的比活为1100U/mg，本申请突变型SOD酶活为1860U/mg。本申请突变体蛋白生产成本低，产量大，具有较大的应用价值，在医药、食品、化妆品等行业有广泛的应用前景。
[0036]实施例1
[0037]突变型耐高温SOD基因的获得
[0038]1.通过NCBI序列检索分析，得到耐高温菌Acidilobus saccharovorans(GenBank登录号：NC_014374.1)，将其编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.5：MVVSLKRYELPPLPYNYDALEPIISAETLRYHHDKHHLGYVNGANAALDKLEKYLNGQLTDIDVRAVSRDFEFNYGGHILHTLYWLNMAPKGKGGGTPGGAIGDAINKFFGSFDKFKKLFGDAAKNVEGVGWAILAYDPVTGDLRILQVEKHNNVVTTNLIPLLAVDVFEHAYYIDYRNDRAKYVDSWWDLI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐高温重组突变型SOD，其特征在于：所述耐高温突重组变型SOD包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。2.一种编码如权利要求1所述的耐高温重组突变型SOD的核苷酸序列，其特征在于：包含编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种重组表达载体，其特征在于：包含如权利要求2或3所述的核苷酸序列。5.一种重组菌，其特征在于：包含如权利要求4所述的重组表达载体。6.一种如权利要求1所述的耐高温重组突变型SOD的制备方法，其特征在于其制备方法包含以下步骤：培养权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂作明，青立军，盖其静，周始煜，
申请(专利权)人：浙江安各洛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：