杜仲漆酶EuLAC1基因及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种杜仲漆酶EuLAC1基因及其用途，所述EuLAC1基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示，本发明专利技术将含有EuLAC1基因的过表达载体转入烟草中，获得的转基因烟草植株的漆酶活性和木质素含量明显增加且对灰霉病的抗性也有明显提高，同时发现转基因烟草木质部导管附近的细胞壁比野生型厚，轮廓更加分明。本发明专利技术证明EuLAC1基因具有提高植物对灰霉病的抗性功能，为今后利用该基因进行植物分子遗传改良提供理论和技术支持，因此具有潜在的应用价值。值。

【技术实现步骤摘要】
杜仲漆酶EuLAC1基因及其用途


[0001]本专利技术属于植物生物
，具体涉及一种新基因(EuLAC1)及其在抗病方面的应用。

技术介绍

[0002]在农业生产中，植物病害尤其是真菌病害一直是限制农作物产量提高的重要因素。目前主要采用化学农药作为防治病害的主要手段，但长期使用化学农药不仅导致病原菌产生抗药性，同时还造成生态环境的破坏。因此，抗病品种选育越来越受关注，成为植物病害的有效防治措施之一。然而，由于常规育种周期长、育种资源有限、病原菌变异迅速，因此不易获得抗性植株，难以满足生产的需要。随着生物工程技术发展，研究者开始利用转基因技术，将外源抗病基因转入植物以提高植株的抗病性；这种方法具有选育速度快，易于获得抗性植株，且具有较好的遗传稳定性等优点，已成为获得抗病性植株的主要手段。
[0003]杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)属于单科单属落叶乔木，别名为胶木，具有广泛的胶用和药用价值，是我国的一种特有经济树种。漆酶(Laccase，LAC)是属于铜蓝氧化酶蛋白家族的一种含四个铜离子的糖蛋白氧化酶，在高等植物中主要影响木质素的合成、植物体内酚类物质含量的调控以及参与到植物对病虫害的抵御等。目前，漆酶在许多高等植物中均有报道，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、棉花(Gossypium spp)、毛果杨(Populus trichocarpa)、烟草(Nicotiana tabacum)以及玉米(Zea mays)等物种。植物漆酶家族成员众多，且不同成员的功能不尽相同，但多数的功能研究还是集中在木质素的合成上。但有关杜仲LAC基因的研究未见报道，其功能机制存在空白。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种杜仲漆酶EuLAC1基因，为植物的基因改造提供了一个新的高效抗病基因，为植物抗病基因工程提供了更多的选择，同时也为通过分子手段改良植物抵抗真菌病害能力奠定了基础。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下方案：
[0006]杜仲漆酶EuLAC1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]编码上述蛋白的杜仲漆酶EuLAC1基因。
[0008]优选其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]一种重组载体，包括上述EuLAC1基因的核苷酸序列。
[0010]一种遗传工程化的宿主细胞，含有上述重组载体。
[0011]上述杜仲漆酶EuLAC1蛋白在植物抵抗疾病中的应用。
[0012]进一步，所述疾病为由灰葡萄孢(Botrytis cinerea，B.cinera)引发的灰霉病。
[0013]一种提高植物对灰霉病抗性的方法，包括以下步骤：将制备的或提供的含有所述的EuLAC1基因的表达载体转化农杆菌，得到农杆菌工程菌，再将所述农杆菌工程菌侵染植物，使EuLAC1基因过表达，即得到转基因植物，以增强抗灰霉病的性能。
[0014]进一步，所述转基因植物漆酶活性增加、木质素含量增加和木质部附近的细胞壁增厚且轮廓清晰。
[0015]本专利技术从杜仲中克隆并获得了杜仲漆酶基因EuLAC1及其序列，对其进行生物信息学分析。通过构建植物过表达载体，遗传转化烟草，从而验证分析EuLAC1基因抗病方面的功能。
[0016]相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0017]本专利技术首次克隆了杜仲漆酶EuLAC1基因，获得其编码的蛋白序列，并将该基因在烟草中表达后，用离体叶片法进行接菌实验，实验结果表明该基因能够明显提高烟草对灰霉病的抗性，为植物抗病基因工程提供了一个高效的抗病基因，并为进一步培育具有真菌抗性的转基因新材料或新品种奠定了基础。利用该方法可以减少农药使用，降低环境污染。本专利技术为今后利用该基因进行植物分子遗传改良提供理论和技术支持，因此，具有重要的推广价值。
附图说明
[0018]图1为杜仲漆酶EuLAC1基因的PCR扩增电泳图；
[0019]图2为植物过表达载体pCAMBIA1300-35S-EuLAC1的图谱示意图；
[0020]图3为烟草遗传转化过程图，A.共培养，B.筛选培养，C.愈伤组织形成，D.不定芽分化，E.抗性苗生根，F.抗性植株移栽；
[0021]图4为转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果电泳图，M：2000Maker，1：阳性质粒对照，2-7：抗性植株，8：野生型烟草，9：转pCAMBIA300-35S-GUS空载烟草；
[0022]图5为EuLAC1在杜仲中的相对表达量，“**”表示差异极显著(P<0.01)；
[0023]图6为阳性转基因烟草中EuLAC1基因的表达量，转pCAMBIA300-35S-GUS空载烟草，
[0024]TP1-TP20为转基因烟草阳性株系，“**”表示差异极显著(P<0.01)，“*”表示差异显著(P<0.05)；
[0025]图7为转基因烟草的漆酶活性，WT：野生型植株，转pCAMBIA300-35S-GUS空载烟草，TP：转基因植株，“**”表示具有极显著差异P<0.01；
[0026]图8为转基因烟草灰霉病抗性实验,A为叶片拍照图，(a)接菌前，(b)接菌3d后，WT：野生型植株，B为病斑直径测量结果图，WT：野生型植株，TP：转基因植株，“**”表示具有极显著差异P<0.01；
[0027]图9为转基因烟草的木质素含量，WT：野生型植株，转pCAMBIA300-35S-GUS空载烟草，TP：转基因植株；A为转基因烟草茎中木质素含量，B为转基因烟草叶中木质素含量，根据最小显著性差异检验，具有相同字母的平均值不具有统计学意义(p<0.01)；
[0028]图10为烟草茎的横截面电镜观察图，WT：野生型植株，TP：转基因植株，放大倍数1000倍；图中箭头所指为：左图为右图圆圈内的放大图。
具体实施方式
[0029]下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。
[0030]下述所用生物材料均为市售，本申请人实验室有保存，可以对外公开发放。
[0031]实施例1杜仲漆酶EuLAC1基因克隆及分析
[0032]采用康为世纪公司的RNA提取试剂盒RNA pure Kit，按说明书步骤提取杜仲RNA，用分光光度计测定RNA的浓度，选取数值在2.0左右的RNA，按照Takara公司的反转录试剂盒说明书合成cDNA，然后进行PCR扩增目的片段。PCR体系如表1所示。
[0033]表1 PCR扩增体系
[0034][0035]其中，正向引物和反向引物为：
[0036]EuLAC1-F:5
’-
ATGGGTTCTTGTATTCTTAAGGCAT-3
’
，
[0037]EuLAC1-R:5
’-
CTAACCTGGATTG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.杜仲漆酶EuLAC1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述蛋白的杜仲漆酶EuLAC1基因。3.根据权利要求2所述的杜仲漆酶EuLAC1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种重组载体，包含权利要求3所述的杜仲漆酶EuLAC1基因。5.根据权利要求4所述的重组载体，命名为所述pCAMBIA1300-35S-EuLAC1，其结构如图2所示。6.一种遗传工程化的宿主细胞，包含权利要求4所述的重组载体。7.权利要求1所述杜仲漆酶EuLAC1蛋白在植物抵抗疾病中...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵懿琛，刘羽倩，刘佳佳，赵德刚，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：