一种催化效率与热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种催化效率与热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体，属于酶工程和基因工程技术领域。本发明专利技术通过对铜绿假单胞菌来源的脂肪氧合酶进行分子改造，经过定点突变或饱和突变，筛选获得催化效率和热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体，催化效率提高了1.4至9.2倍，在50℃下孵育，半衰期T

【技术实现步骤摘要】
一种催化效率与热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体


[0001]本专利技术涉及一种催化效率与热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体，属于酶工程和基因工程


技术介绍

[0002]脂肪氧合酶(Lipoxygenase，简称LOX，EC.1.13.11.12)是一种不饱和脂肪酸过氧化物酶，能催化多不饱和脂肪酸与一个或多个顺式、顺式
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1,4
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戊二烯结构的特异性双加氧反应，生成氢过氧化物，这些氢过氧化物进一步转化为一系列具有生物活性的氧化脂质，其能广泛应用于食品、化工、制药和其他行业。例如，脂肪氧合酶不仅可以通过调节小麦面筋中二硫键的形成显著改善白面包和面食的质地，还可以替代面粉和乳制品的化学漂白剂以获得所需的颜色。脂肪氧合酶产生的氢过氧化物是可再生油工业转化为醇类、羰基化合物、环氧化物、中链羟基脂肪酸和二酸的宝贵中间体，可用于聚合物和生物柴油生产。此外，脂肪氧合酶衍生产品可进一步转化为重要的生物活性脂质介质，用于治疗炎症和癌症。与化学方法相比，上述脂肪氧合酶催化反应具有高度的特异性、安全性、健康性和环境友好性。
[0003]商用脂肪氧合酶主要通过提取植物组织或果实来提取。然而，由于原材料中同工酶的混合和低效的提取方法，脂肪氧合酶的质量难以控制。微生物发酵生产的脂肪氧合酶，通过重组表达具有纯度高、特异性强的优点，但催化效率低、稳定性差，不适合于许多工业应用。为了实现脂肪氧合酶在工业上的低成本应用，高催化效率和稳定性至关重要。
[0004]研究表明，不同来源的脂肪氧合酶性质相差甚远，而通过分子改造能有效提高酶的催化活性及稳定性，有望实现重组表达的脂肪氧合酶在工业中的广泛应用。目前，LOX分子改造的研究主要集中在结构和功能关系的解析，而通过分子改造来提高LOX催化效率及稳定性的报道则较少。
[0005]因此，以低成本的工业应用为目标，提供一种提高脂肪氧合酶催化活性和热稳定性的方法，对于脂肪氧合酶的生产应用具有重要价值。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一个目的是提供催化效率与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体，所述突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1序列为亲本，将亲本第141位、第151位、第159位或第582位发生突变。
[0007]在一种实施方式中，所述亲本的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]在一种实施方式中，将第141位的脯氨酸突变为半胱氨酸；将第151位的苯丙氨酸突变为精氨酸、丝氨酸或赖氨酸；将第159位的异亮氨酸突变为天冬氨酸或赖氨酸；将第582位的酪氨酸突变为甲硫氨酸。
[0009]本专利技术的第二个目的是提供编码所述脂肪氧合酶突变体的基因。
[0010]在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3～9所示。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供含有所述基因的重组质粒。
[0012]在一种实施方式中，所述重组质粒的表达载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。
[0013]在一种实施方式中，以pET22b(+)为载体。
[0014]本专利技术的第四个目的是提供表达所述脂肪氧合酶突变体或含有所述重组质粒的宿主细胞。
[0015]在一种实施方式中，以大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)为宿主，表达所述脂肪氧合酶突变体。
[0016]本专利技术的第五个目的是提供一种提高脂肪氧合酶性能的方法，对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪氧合酶进行改造，将其第141位、第151位、第159位或第582位发生突变；所述性能包括热稳定性、催化效率。
[0017]在一种实施方式中，将第141位的脯氨酸突变为半胱氨酸；将第151位的苯丙氨酸突变为精氨酸、丝氨酸或赖氨酸；将第159位的异亮氨酸突变为天冬氨酸或赖氨酸；将第582位的酪氨酸突变为甲硫氨酸。
[0018]本专利技术的第六个目的是提供所述脂肪氧合酶突变体的构建方法，包含如下步骤：
[0019](1)基于计算机辅助合理设计，使用定点突变引物通过全质粒扩增获得目标突变体。
[0020](2)使用简并引物通过全质粒PCR对候选氨基酸位点进行饱和诱变。
[0021]本专利技术的第七个目的是提供一种生产所述脂肪氧合酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
[0022](1)将所述宿主细胞的单菌落分别接种至20mL LB液体培养基中，于温度37℃、220rpm的条件下培养8
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10h，得到种子液；
[0023](2)将种子液以4％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基中，于温度25℃、220rpm的条件下培养12h，得到宿主细胞的培养液；
[0024](3)将培养液离心后收集细胞，经均质机破碎后于10000
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12000rpm、4℃的条件下离心15
‑
30min，得到培养宿主细胞得到的粗酶液。
[0025](4)将粗酶液进行镍柱亲和层析，得到脂肪氧合酶的纯酶液。
[0026]本专利技术的第八个目的是提供一种催化多不饱和脂肪酸的方法，以多不饱和脂肪酸为底物，利用所述突变体为催化剂，在pH7.0～8.0、20～50℃反应。
[0027]在一种实施方式中，在pH7.0～7.5、25～30℃反应。
[0028]在一种实施方式中，所述多不饱和脂肪酸包括但不限于亚油酸、α
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亚麻酸、花生四烯酸。
[0029]本专利技术的第九个目的是提供所述突变体，或所述基因，或所述宿主细胞在催化多不饱和脂肪酸中的应用。
[0030]本专利技术的有益效果：
[0031]本专利技术通过对铜绿假单胞菌来源的脂肪氧合酶进行分子改造，分别对其141、151、159、346、388、392、393、395～397、403、404、639～641位等多个位点进行突变并筛选，最终获得催化效率与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体。与野生型铜绿假单胞菌来源的脂肪氧合酶的催化效率相比，本专利技术提供的脂肪氧合酶突变体的催化效率较优化前提高了1.4
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9.2倍，其在50℃条件下的半衰期最长达到11.6min，较野生型提升了165.7％。显著提
高脂肪氧合酶的催化效率和热稳定性，解决了脂肪氧合酶催化效率低和热稳定性差的问题，为其工业化应用奠定了基础。
附图说明
[0032]图1为基于半理性设计的候选突变残基分析及突变体文库筛选结果分析图，其中图A为候选残基虚拟饱和突变后的最小自由能热图；图B为阳性突变体的比酶活提高倍数。
[0033]图2为候选残基的饱和突变和阳性突变株的筛选结果分析图，其中图A为候选残基的饱和突变比酶活筛选结果分析；图B为阳性突变比酶活提高倍数分析。
[0034]图3为PaLOX及其突变体的最适反应温度和热稳定性图，其中图A和图B分别为PaL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.脂肪氧合酶突变体，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO.1序列为亲本，将亲本第141位、第151位、第159位或第582位发生突变。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，将第141位的脯氨酸取代为半胱氨酸；将第151位的苯丙氨酸取代为赖氨酸、精氨酸或丝氨酸；将第159位的异亮氨酸取代为赖氨酸或天冬氨酸；将第582位酪氨酸取代为甲硫氨酸。3.编码权利要求1所述脂肪氧合酶突变体的基因。4.含有权利要求3所述基因的重组质粒。5.表达权利要求1或2所述突变体或含有权利要求4所述重组质粒的宿主细胞。6.一种提高脂肪氧合酶性能的方法，其特征在于，对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪氧合酶进行改造，将其第141位、第151位、第159位或第...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国强，刘松，李江华，庞翠萍，周景文，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：