一种生产肌苷的基因工程菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种生产肌苷的基因工程菌株及其构建方法与应用。该基因工程菌株异源过表达核苷转运蛋白基因pbuE，嘌呤操纵子突变基因purEKBCSQLF

【技术实现步骤摘要】
一种生产肌苷的基因工程菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种生产肌苷的基因工程菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]肌苷是一种嘌呤核苷，参与机体物质代谢和能量代谢，具有重要的应用价值。微生物发酵法是目前工业生产肌苷的主要方法，但由于现存菌株的发酵性能较差，发酵法生产肌苷的生产水平仍较低，亟需高性能的菌株以满足肌苷的产业化需求。传统肌苷生产菌株的选育是通过诱变筛选结构类似物抗性菌株获得，然而由于遗传背景不清晰和大量负向突变的积累，不利于诱变所得菌株性能的持续改良。随着系统生物学的发展，代谢工程等理性构建的方法逐渐成为肌苷生产菌株从头构建和持续改良的首选方法。现有研究成果已为肌苷工程菌株的理性构建提供了重要参考，但仍存在许多问题尚未解决。具体表现在：(1)目前理性构建菌株的肌苷生产性能普遍偏低，最高产量仅为14g/L，且生产周期较长，普遍长达72h甚至更久。(2)菌株多携带质粒，菌体负担重，并且质粒易丢失会造成生产的不稳定。为维持质粒的稳定存在需添加抗生素，不仅提高了生产成本，也增加耐药性等安全隐患。(3)在构建策略方面，现有菌株多局限在对降解途径、从头合成途径、前体合成途径和分支代谢途径等个别节点进行改造，缺乏对整个肌苷代谢网络各模块的系统组合。(4)菌株多为腺嘌呤缺陷型，发酵过程中需要添加腺嘌呤，原料成本高、发酵工艺复杂、生产稳定性降低。
[0003]常见的肌苷生产菌株从头构建策略主要包括阻断降解途径、加强从头合成途径、加强前体合成途径与阻断分支代谢途径四个方面。Shimaoka M等(Effect of amplification of desensitized purF and prs on inosine accumulation in Escherichia coli.Journal of bioscience and bioengineering,2007,103(3):255
‑
261.)以大肠杆菌W3110为出发菌株，通过敲除deoD和xapA基因，阻断了肌苷降解途径；通过敲除purR基因和过表达purF
K326Q,P410W
基因，加强了从头合成途径；通过敲除pgi、edd基因及过表达prs
D128A
基因，加强了前体合成途径；通过敲除purA基因，阻断了腺苷合成支路。所得菌株I
‑
9m/pMWKQ
‑
pSTVDA经72h发酵，肌苷的产量达到7.5g/L。Asahara T等(Accumulation of gene
‑
targeted Bacillus subtilis mutations that enhance fermentative inosine production.Appl Microbiol Biotechnol,2010,87(6):2195
‑
2207.)以枯草芽胞杆菌W168为出发菌株，通过敲除deoD和punA基因，阻断了肌苷降解途径；通过敲除purR基因、嘌呤操纵子的5'
‑
UTR区及优化嘌呤操纵子启动子的
‑
10区，加强了从头合成途径；通过敲除purA和guaB基因，阻断了腺苷合成支路和鸟苷合成支路。所得菌株KMBS375经72h发酵，肌苷的产量达到6g/L。李昊剑等(De novo engineering and metabolic flux analysis of inosine biosynthesis in Bacillus subtilis.Biotechnol Lett,2011,33(8):1575
‑
1580.)以枯草芽胞杆菌W168为出发菌株，通过敲除deoD基因，阻断了肌苷降解途径；通过敲除purA基因，阻断了腺苷合成支路。所得菌株BS019经72h发酵，肌苷产量达到7.6g/L。温廷益等(CN106906174A)以枯草芽胞杆菌W168为出发菌株，通过敲除purA基因，阻断了腺苷合
成支路；通过敲除drm基因，阻断了核糖1
‑
磷酸向核糖5
‑
磷酸的降解途径。所得菌株IR
‑
2经72h发酵，肌苷产量达到14g/L，这是目前为止理性构建菌株中肌苷最高产量。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术的目的是构建一株高效稳定生产肌苷的工程菌株并利用该菌株发酵生产肌苷，本专利技术从大肠杆菌基因组水平出发，主要通过代谢工程技术手段，对肌苷分解途径、肌苷合成途径、肌苷转运系统及分支代谢途径各模块进行系统全面的组合优化，提高菌株的肌苷发酵性能。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采取如下的技术方案：
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，该基因工程菌株异源过表达核苷转运蛋白基因pbuE，嘌呤操纵子突变基因purEKBCSQLF
K316Q
MNHD和PRPP转酰胺酶突变基因purF
K316Q
，并且以异源腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA
P242N
替换了基因purA，并且不表达嘌呤核苷磷酸化酶基因deoD、ppnP以及核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC。
[0007]第二方面，本专利技术提供了如上所述的大肠杆菌基因工程菌株的构建方法，包括：在出发菌株大肠杆菌中引入核苷转运蛋白基因pbuE，嘌呤操纵子突变基因purEKBCSQLF
K316Q
MNHD和PRPP转酰胺酶突变基因purF
K316Q
，并且以异源腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA
P242N
替换了基因purA，并且将嘌呤核苷磷酸化酶基因deoD、ppnP以及核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC敲除或失活。
[0008]第三方面，本专利技术提供了如上所述的大肠杆菌基因工程菌株在高产肌苷中的用途。
[0009]本专利技术的有益效果如下：
[0010]本专利技术利用理性代谢工程改造的方法获得了具有清晰遗传背景，不含质粒并且高效生产肌苷的工程菌株。从生产表型来看，本专利技术所述菌株在5L罐上发酵48h，肌苷产量达到了20.16g/L，与现有技术目前理性构建菌株的最高产量相比提高了42.8％，发酵周期缩减1/3，且不含质粒。从构建策略来看，本专利技术通过代谢工程技术手段，分模块对肌苷分解途径、肌苷合成途径、肌苷转运系统及分支代谢途径进行了系统全面的组合优化，菌株遗传背景清晰且生产性能更高更稳定。特别地，相比其他肌苷生产菌株，本专利技术通过弱化而非直接阻断腺苷合成支路的方法，既保证了足够的肌苷支路通量，又维持了菌株一定的生长水平。最终所得菌株可稳定高效生产肌苷，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
[0011]图1A：deoD基因敲除片段的构建及验证电泳图。其中，M：Marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：阳性菌鉴定片段本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
g/L，FeSO4·
7H2O 5
‑
20 mg/L，MnSO4·
H2O 5
‑
20 mg/L，V
B1
、V
B3
、V
B5
、V
B12
和V...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢希贤，朱彦凯，刘铁重，吴鹤云，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：