本发明专利技术公开了一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，旨在提供一种采用细胞作为检测手段用于评价化妆品舒缓功效的测试方法，该方法采用细胞替代人体试验，符合实验动物“3R”原则，测试方法经济快捷，测试过程可控，测试体系标准化，避免因人体个体差异引起的较大的结果偏差。所述测试方法为，体外培养小鼠巨噬细胞株，将待测样品加入细胞中进行测试，首先测试样品的细胞毒性，再选择无细胞毒性的浓度进行一氧化氮(NO)释放抑制试验，通过统计学手段分析评价样品的舒缓功效。本测试方法还通过多次实际应用，建立了舒缓功效的判定标准。本测试方法用于评价化妆品及其原料的舒缓功效评价，属于化妆品技术领域。属于化妆品技术领域。属于化妆品技术领域。
【技术实现步骤摘要】
一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法
[0001]本专利技术涉及一种测试方法，具体地说，是一种化妆品及其原料舒缓功效的测试方法；属于化妆品测试
技术背景
[0002]化妆品的舒缓功效，指使用化妆品后有助于改善皮肤刺激等状态。具有舒缓功效的化妆品，应当通过化妆品功效宣称评价试验方式，可以同时结合文献资料或研究数据分析结果，进行功效宣称评价。根据化妆品功效宣称评价项目要求，舒缓功效可采用人体功效评价试验、消费者使用测试和实验室试验三种方法中任一种方法进行评价。但是，目前，针对舒缓功效的评价方法，还未有国家标准和行业标准。
[0003]脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是一种内毒素，来源于革兰氏阴性菌，能够对机体造成刺激，引起机体的发热等炎症反应。LPS可诱导巨噬细胞RAW264.7株产生过敏反应，释放NO(一氧化氮)，NO作为炎症反应的关键因子，在内毒素致机体损伤中起重要作用，过多的NO可以促进巨噬细胞释放IL
‑
6、TNF
‑
α，而这些炎症因子又可以促进细胞分泌更多的NO，形成恶性循环，加重炎症反应。NO在体内或水溶液中极易氧化成NO2，在酸性条件下，NO与重氮盐磺胺发生重氮反应，并生成重氮化合物，后者进一步与萘基乙烯基二胺发生耦合反应，该反应生成的产物浓度与NO浓度具有线性关系，在540nm处有最大吸收峰。
技术实现思路
[0004]为此，本专利技术的目的是通过检测样品对NO释放的抑制作用，从而评价样品对细胞炎症反应的舒缓作用，从而评价样品的舒缓功效；该方法经济快捷，测试过程可控，测试体系标准化，避免因人体个体差异引起的较大的结果偏差
[0005]一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，依次包括下述步骤：
[0006]1)体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7株，本专利技术所述的小鼠巨噬细胞RAW264.7株，是一种传代细胞系，可来源于各个细胞保藏中心或其他商业模式购得；
[0007](2)调整小鼠巨噬细胞细胞浓度至5.0
×
104～2.0
×
105cell/mL，加入细胞培养板中，培养24
‑
48h至细胞融合度达50％以上时用于细胞毒性检测；
[0008](3)将(2)培养好的细胞板，弃去培养液；将样品用细胞培养基稀释成不同浓度(具体浓度梯度。说明：稀释浓度根据实际情况而定，没有特殊要求，目的就是要找出无细胞毒性的浓度)，加入细胞板中，同时设不加样品的细胞对照组、不加细胞及样品的空白对照组，100μl/孔，培养44
‑
48h后，显微镜下观察细胞状态，弃去培养液，洗细胞板1
‑
2次，加入MTT溶液，继续培养2
‑
6h，弃去培养液，加入150μl/孔的DMSO，震荡5
‑
10min，于570nm处测定吸光值。根据结果采用公式细胞活力(％)＝(T
‑
C)/(N
‑
C)
×
100％计算细胞活力，其中T为样品组的OD值，N为细胞对照组的OD值，C为空白组的OD值。根据细胞活力结果并结合细胞形态，筛选出细胞活力在85％或以上、细胞形态与细胞对照组无明显差异的浓度，作为无明显细胞毒性的样品浓度供下一步实验；
[0009](4)重新培养细胞，调整细胞浓度至1.0
×
106～3.0
×
106cell/mL，加入细胞培养板中，100μl/孔，培养20～24h至细胞融合度达80％以上时用于NO释放抑制测试；
[0010](5)将(4)培养好的细胞板，弃去培养液，洗细胞板1
‑
2次，根据(3)的结果，将样品稀释至2倍无明显细胞毒性的浓度，加入细胞板中，50μl/孔，共加样6孔，每孔补加50μl含LPS的营养液，同时设空白对照和阳性对照，其中空白对照加100μl/孔的含2％牛血清的DMEM，阳性对照用50μl/孔的无血清培养基补加50μl/孔的LPS营养液，加样完毕，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24h，培养结束后，从细胞板中每孔取50μl培养液放入新的细胞板，加入等体积的Griess试剂，充分混合后，于暗处反应10min，在540nm处检测OD值，记录结果；
[0011](6)结果统计分析
[0012]NO相对含量(％)＝OD
样品
/OD
PC
×
100％
[0013]NO抑制率(％)＝(OD
PC
‑
OD
样品
)/OD
PC
×
100％
[0014]式中，OD
样品
指样品组的OD值均值，OD
PC
为阳性对照组的OD值均值；
[0015](7)根据步骤(6)统计结果判定测试样品是否具有舒缓功效
[0016]进一步的，上述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，所述的小鼠巨噬细胞RAW264.7株的培养方法为：
[0017]进一步的，上述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，所述的细胞培养板为96孔细胞培养板。
[0018]进一步的，上述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，所述步骤2)至步骤4)所述的培养是将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24～48h。
[0019]进一步的，上述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，所述洗细胞板采用PBS溶液洗。
[0020]进一步的，上述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，所述判定标准为，步骤7)所述的判定方法为：当空白对照组(NC组)的NO相对含量≤50％时，试验成立；再用GraphPad Prism软件进行统计及显著性分析，计算P值，P＜0.01表示具有显著性差异；当P＜0.01且NO抑制率≥10％时，可判定为样品具有舒缓功效；否则判定为样品无舒缓功效。
[0021]与现有技术相比，本专利技术提供的技术方案采用体外培养小鼠巨噬细胞株，将待测样品加入细胞中进行测试，首先测试样品的细胞毒性，再选择无细胞毒性的浓度进行一氧化氮(NO)释放抑制试验，通过统计学手段分析评价样品的舒缓功效。本测试方法还通过多次实际应用，建立了舒缓功效的判定标准，该方法经济快捷，测试过程可控，测试体系标准化，避免因人体个体差异引起的较大的结果偏差。本专利技术公开的方法属于实验室试验方法。
附图说明
[0022]图1是样品的细胞毒性曲线图
[0023]图2是NO释放结果分析图；
[0024]图3是样品的细胞毒性曲线图；
[0025]图4是NO释放结果分析；
[0026]图5是样品的细胞毒性曲线图；
[0027]图6是NO释放结果分析；
[0028]图7是样品的细胞毒性曲线图；
[0029]图8是NO释放结果分析。
具体实施方式
[0030]下面对本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1)体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7株，；(2)调整小鼠巨噬细胞细胞浓度至5.0
×
104～2.0
×
105cell/mL，加入细胞培养板中，培养24
‑
48h至细胞融合度达50％以上时用于细胞毒性检测；(3)将(2)培养好的细胞板，弃去培养液；将样品用细胞培养基稀释50％浓度，再按的稀释因子稀释成8个不同浓度，加入细胞板中，同时设不加样品的细胞对照组、不加细胞及样品的空白对照组，100μl/孔，培养44
‑
48h后，显微镜下观察细胞状态，弃去培养液，洗细胞板1
‑
2次，加入MTT溶液，继续培养2
‑
6h，弃去培养液，加入150μl/孔的DMSO，震荡5
‑
10min，于570nm处测定吸光值；根据吸光值测定结果，采用公式细胞活力(％)＝(T
‑
C)/(N
‑
C)
×
100％计算细胞活力；根据细胞活力结果，筛选出细胞活力在85％或以上的样品浓度，作为无明显细胞毒性的样品浓度供下一步实验；其中T为样品组的OD值，N为细胞对照组的OD值，C为空白组的OD值；(4)重新培养细胞，调整细胞浓度至1.0
×
106～3.0
×
106cell/mL，加入细胞培养板中，100μl/孔，培养20～24h至细胞融合度达80％以上时用于NO释放抑制测试；(5)将(4)培养好的细胞板，弃去培养液，洗细胞板1
‑
2次，根据(3)细胞毒性检测的结果，将样品稀释至2倍无明显细胞毒性的浓度，加入细胞板中，50μl/孔，共加样6孔，每孔补加50μl含LPS的营养液，同时设空白对照和阳性对照，其中空白对照加100μl/孔的含2％牛血清的DMEM，阳性对照用50μl/孔的无血清培养基补加50μl/孔的LPS营养液，加样完毕，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭沈涛，徐文枫，陈媛，崔玉矫，李适炜，
申请(专利权)人：广东悠质检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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