一种新型冠状病毒抑制剂筛选的方法技术

本发明专利技术提供一种新型冠状病毒抑制剂筛选的方法，属于生物分析检测领域。该方法通过荧光成像，采集活细胞内变化的荧光信号实现抑制剂的筛选。具体的方法是，首先通过基因工程方法分别在新型冠状病毒的受体结合蛋白(RBD)及其受体人源血管紧张素转化酶2(hACE2)融合上标签蛋白，小分子荧光探针能够专一的标记这两个蛋白。在细胞内过表达hACE2融合蛋白并荧光标记，荧光标记的RBD蛋白能够专一的识别活细胞内hACE2蛋白，在荧光显微镜下呈现叠加的荧光信号。以hACE2的荧光信号作为参比，当抑制剂分子与荧光标记的RBD蛋白共孵育时，RBD荧光信号减弱，从而筛选出新冠病毒抑制剂，并且能够检测抑制效率。该方法具有灵敏、快速的特点，能够在活细胞内实时筛选新冠病毒抑制剂。够在活细胞内实时筛选新冠病毒抑制剂。

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒抑制剂筛选的方法


[0001]本专利技术属于生物分析检测领域，具体涉及一种新型冠状病毒抑制剂筛选的 方法。

技术介绍

[0002]目前还没有治疗新冠病毒的特效药物，因此药物发现与筛选工作成为部分 研究人员关注的重点。
[0003]冠状病毒是由核壳蛋白包裹单链RNA组成，COVID
‑
19感染细胞的机制与 SARS
‑
CoV相似，都是通过病毒表面的刺突S蛋白与人细胞膜蛋白血管紧张素 转化酶2(hACE2)结合，在蛋白酶的作用下，内呑进入细胞内，然后释放RNA 感染。COVID
‑
19的S蛋白与SARS
‑
CoV的S蛋白有近80％的同源性，都是由 S1和S2两个亚基组成，其中，S2亚基包含疏水单元，用于侵染细胞膜。而S1 亚基包含一个受体结合部位RBD(receptor
‑
binding domain)，用于识别宿主细胞 的ACE2蛋白。研究显示hACE2与COVID
‑
19的RBD
‑
SD1蛋白的结合力是34.6 nM，为与SARS
‑
CoV的RBD
‑
SD1蛋白(K
D
＝325.8nM)结合力的近10倍，这 解释了COVID
‑
19的感染性更强的原因。
[0004]由于RBD与hACE2相互作用是病毒侵染细胞的关键，因此其活性中心部 位成为疫苗与药物开发的重要靶点，研究人员认为筛选出靶向hACE2
‑
RBD作用 活性位点的药物，阻止病毒结合hACE2侵染细胞可能是其快速治疗方案。因此， 一种快速、高效、灵敏的筛选方法是必不可少的。目前，已经有大量研究者应 用计算机模拟的方法筛选hACE2或者RBD的抑制剂，但是计算机模拟法无法 还原蛋白的真实环境，误差较大；商业化的新冠病毒RBD抑制剂筛选试剂盒通 常是在体外环境利用ELISA方法检测，存在非原位，误差大，信号弱等缺点； 而应用假病毒原位侵染过表达hACE2细胞的方法则耗时长，无法通量的筛选。
[0005]荧光检测技术因具有原位检测、筛选通量高、检测成本低、检测仪器成熟 等突出优势，是药物筛选常用的手段。但是目前还没有荧光体系应用于 hACE2
‑
RBD相互作用活性位点抑制剂的筛选。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的开发一种新型冠状病毒抑制剂筛选的 方法，该方法通过荧光成像，采集活细胞内变化的荧光信号实现抑制剂的筛选。 具体的方法是，首先通过基因工程方法分别在新型冠状病毒的RBD及其受体 hACE2融合上标签蛋白，使小分子荧光探针能够专一的标记这两个蛋白。然后 在细胞内过表达hACE2融合蛋白并荧光标记，荧光标记的RBD蛋白能够专一 的识别活细胞内hACE2蛋白，在荧光显微镜下呈现叠加的荧光信号。以hACE2 的荧光信号作为参比，当抑制剂分子与荧光标记的RBD蛋白共孵育时，RBD荧 光信号减弱，从而筛选出抑制剂分子，并且能够检测抑制效率。该方法具有灵 敏、快速的特点，能够在活细胞内实时筛选新冠病毒抑制剂
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供一种新型冠状病毒抑制剂筛选的方法，该筛 选步骤为：
[0008](1)在细胞内过表达标签蛋白
‑
hACE2融合蛋白质粒。
[0009](2)加入含上述标签蛋白专一底物的荧光探针，孵育10
‑
30min，洗一遍；
[0010](3)加入荧光标记的RBD
‑
标签蛋白融合蛋白，或者抑制剂和荧光标记的RBD
‑ꢀ
标签蛋白的混合物，孵育30
‑
120min；
[0011](4)荧光成像，定性筛选抑制剂；
[0012](5)分析成像数据，定量检测抑制剂的抑制率。
[0013]其中步骤(1)所述的标签蛋白
‑
hACE2融合蛋白，是分别将SNAP、Halo、 CLIP、或者PYP标签蛋白融合在hACE2蛋白的N端。
[0014]步骤(2)所述的含标签蛋白专一底物的荧光探针为不透膜的探针。
[0015]步骤(3)所述的RBD
‑
标签蛋白融合蛋白是将SNAP、Halo、CLIP或者PYP 标签蛋白融合在RBD蛋白的C端或者N端
[0016]步骤(4)所述通过荧光成像结果定性筛选抑制剂的具体过程是，先利用标 签蛋白
‑
hACE2的荧光通道确定过表达了hACE2的细胞，然后以只加RBD
‑
标签 蛋白
‑
染料的细胞的RBD荧光通道的荧光强度为标准，通过观察加了抑制剂的细 胞的荧光强弱确定抑制剂的抑制作用，荧光弱说明有抑制作用，荧光强则无抑 制作用。
[0017]步骤(5)所述的数据分析具体过程为，统计10
‑
100个过表达标签蛋白
‑
hACE2 细胞的平均荧光强度和以及成像图片背景的平均荧光强度 得到和和和
[0018]以只加RBD
‑
标签蛋白
‑
染料成像图片的IF
640
/IF
561
作为100％的RBD 相对活性，加入抑制剂的细胞成像的IF
640
/IF
561
与该值作对比，得到抑制剂的抑 制率。
[0019]所述的一种新型冠状病毒抑制剂筛选的方法，其特征在于：筛选出的抑制 剂能够抑制hACE2与新型冠状病毒的S蛋白的结合，该抑制剂可以是hACE2 的抑制剂，即与hACE2相互作用；也可以是S蛋白的受体结合部分RBD的抑 制剂。
[0020]本专利技术的优点和有益效果为：
[0021](1)本专利技术在活细胞内原位成像与筛选，筛选出的抑制剂应用性更高；
[0022](2)通过基因工程方法将蛋白标签融合到目标蛋白上，其优点是根据所用 的仪器或者荧光通道不同，可以选择性的将任一带有专一底物的小分子荧光团 标记到目标蛋白上应用。
[0023](3)以hACE2的荧光为参比，通过双通道的平均荧光比值能够定性和定 量的筛选抑制剂；
[0024](4)本筛选方法能够同时筛选hACE2
‑
RBD相互作用位点的hACE2或者RBD的抑制剂分子。
附图说明
[0025]图1不同染料标记各式标签蛋白
‑
hACE2的Hela细胞成像图
[0026]图2为荧光探针与RBD蛋白作用前后的SDS
‑
PAGE电泳图。
[0027]图3为转染了SNAP
‑
hACE2的Hela细胞的荧光共聚焦成像。
[0028]图4为通过荧光比率的方法检测的RBD525与RBD541蛋白活力图谱。
[0029]图5为转染了SNAP
‑
hAC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒抑制剂筛选方法，其特征在于，该方法通过荧光成像，采集活细胞内变化的荧光信号实现抑制剂的筛选。2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抑制剂筛选方法，其特征在于，该方法分别在新型冠状病毒的受体结合蛋白(RBD)及其受体人源血管紧张素转化酶2(hACE2)融合上标签蛋白，小分子荧光探针专一标记RBD和hACE2，以hACE2的荧光信号作为参比，根据RBD荧光信号减弱，从而筛选出新冠病毒抑制剂。3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抑制剂筛选方法，其特征在于，该筛选方法具体步骤为：(1)在细胞内过表达标签蛋白
‑
hACE2融合蛋白质粒；(2)加入含上述标签蛋白专一底物的荧光探针；(3)加入荧光标记的RBD
‑
标签蛋白融合蛋白，或者抑制剂和荧光标记的RBD
‑
标签蛋白的混合物，孵育30
‑
120min；(4)荧光成像，定性筛选抑制剂；(5)分析成像数据，定量检测抑制剂的抑制率。4.根据权利要求3所述的一种新型冠状病毒抑制剂筛选方法，其特征在于：步骤(1)所述的标签蛋白
‑
hACE2融合蛋白具体为：分别将SNAP、Halo、CLIP、或者PYP标签蛋白融合在hACE2蛋白的N端。5.根据权利要求3所述的一种新型冠状病毒抑制剂筛选方法，其特征在于：步骤(2)所述的含标签蛋白专一底物的荧光探针为不透膜的探针。6.根据权利要求3所述的一种新型冠状病毒抑制剂筛选的方法，其特征在于：步骤(3)所述的RBD
...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，苗露，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：