一种筛选抑制肠道脂肪酸摄取及防治脂肪肝的药物靶点及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，公开了一种筛选抑制肠道脂肪酸摄取及防治脂肪肝的药物靶点及其应用。依据敲除小鼠实验，本发明专利技术提供了药物作用靶点Soat2(Sterol O

【技术实现步骤摘要】
一种筛选抑制肠道脂肪酸摄取及防治脂肪肝的药物靶点及其应用
[0001]技术邻域
[0002]本专利技术属于生物医药领域，公开了一种筛选抑制肠道脂肪酸摄取及防治脂肪肝的药物靶点及其应用。

技术介绍

[0003]非酒精性脂肪肝是目前一种临床常见疾病，主要由于肝脏代谢异常导致过多甘油三酯蓄积致肝细胞变性进而发生炎症反应。脂肪肝进展可能形成肝纤维化，并成为最终导致肝癌的恶性进程。脂肪肝的形成与肥胖、糖尿病、心血管疾病等疾病相互关联和影响。在脂肪肝发生机制上，与肠道摄取外源性脂肪酸增加和/或体内脂肪酸合成增多有关。脂肪肝的治疗措施目前较为局限，主要为危险因素干预治疗和调节脂质代谢的药物治疗。比如肥胖人群中，非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发生率高达75％。目前除减重代谢手术外，对肥胖及脂肪肝的治疗主要以降脂药物为主。临床使用的降脂药物大多靶向于肝脏，通过促进脂质清除和代谢来达到降脂的目的。比如目前临床上应用最广泛的一类降脂药
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他汀类药物。它通过抑制细胞内胆固醇早期合成阶段的限速酶——三羟基三甲基戊二酰辅酶A(HMG
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CoA)还原酶，减少胞内游离胆固醇，加速循环中脂蛋白的清除。他汀类药物降低循环脂蛋白胆固醇的作用虽然与剂量有一定的相关性，但非直线相关。标准的他汀药物剂量往往不足以达到治疗的目的。其原因可能是他汀类在抑制胆固醇的同时，肠道脂质吸收代偿性增加，其调脂作用被抵消
[1]。另外，如贝特类药物主如非诺贝特，苯扎贝特，通过激活过氧化物酶增殖体激活受体(PPARa)，诱导脂蛋白酯酶表达，促进富含甘油三酯的脂蛋白颗粒中甘油三酯水解，导致血浆极低密度脂蛋白(VLDL)减少。并且促进肝脏摄取脂肪酸和抑制肝脏合成甘油三酯，还抑制脂肪组织的激素敏感性酯酶以减少脂肪酸的生成，进一步抑制肝脏合成甘油三酯。虽然降脂药物在一定程度上促进了脂蛋白的清除，但其大量肠道吸收仍然存在，无法从根源上抑制肥胖的形成，且长期使用药物本身也有影响肝功能的潜在副作用。其他如胆碱、氮氨酸、维生素、氨基酸制剂，则只是在保护肝细胞进一步损伤方面起到作用，延缓脂肪肝进程，但并不针对改善肝脏代谢的异常。
[0004]Soat2(Sterol O
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acyl transferase,甾醇O酰基转移酶),作为胆固醇酯化的关键酶,已知其在胆固醇代谢中发挥重要作用。但是事实上，肠道对于胆固醇与脂肪酸的吸收作用机理是不同的。在整个消化道中，胆固醇的吸收主要发生在上中段。这与胆固醇吸收关键蛋白Niemann
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Pick C1Like1(NPC1L1)在小肠该部位的高表达有关。NPC1L1能特异性结合胆固醇，暴露内吞信号，通过囊泡内吞作用，吸收肠腔内游离胆固醇。而脂肪酸的肠道吸收主要通过蛋白依赖转运，白细胞分化抗原36(CD36)、脂肪酸结合蛋白(FATP4)被认为参与肠道脂肪酸摄取的脂肪酸转运相关蛋白。其中，CD36是肠细胞脂肪酸的最佳转运体。此外，研究发现，抑制肠道对胆固醇的吸收，对肠道脂肪酸摄取影响很小
[2,3]。而饮食中的饱和脂肪酸(saturated fatty acids,SFA)会促进肠道胆固醇转运相关蛋白的表达，促进肠道对胆固醇的吸收，增加血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL
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C)
[4,5]。因此，若只限制肠道胆固醇的吸收，
往往达不到预期的降脂效果。近年来提出的抑制肠道吸收的降脂药物，大多通过抑制肠道对饮食和胆汁中胆固醇的吸收，来达到降脂的目的，且此类药物上市很少。依折麦布(ezetimibe)是目前唯一发现具有附着在小肠绒毛上皮的刷状缘，靶向抑制甾醇载体NPC1L1，抑制胆固醇的吸收的药物，从而减少肠道中的胆固醇摄取，促进血液胆固醇的清除。但临床研究发现，依折麦布与他汀类药物联用，虽然能在一定程度上降低血清LDL
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C水平，但未能达到阻断后续肥胖相关疾病的进展
[6]。若能发现通过抑制肠道脂肪酸摄取从而缓解肥胖及脂肪肝的靶点，研制出以相应蛋白为靶点的降脂药筛选模型及方法，脂肪肝、肥胖等脂质代谢相关疾病的治疗将是一次强有力的推动。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术的第一个目的是，提供抑制肠道脂肪酸吸收的药物靶点和以该蛋白为靶点的降脂药物筛选模型。
[0006]第二个目的是，提供利用药物筛选模型筛选以肠道Soat2蛋白为靶点的降脂药物的方法。
[0007]本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
[0008]Soat2作为靶点在筛选抑制肠道脂肪酸摄取的药物中的应用。
[0009]Soat2作为靶点在筛选降脂药物中的应用。
[0010]Soat2作为靶点在筛选治疗脂肪肝的药物中的应用。
[0011]Soat2作为胆固醇酯化的关键酶，仅在肠道吸收性细胞及肝脏肝细胞表达。本专利技术发现除了以往研究的抑制肠道游离胆固醇的吸收外，Soat2在抑制肠道脂肪酸吸收方面也具有关键作用。本研究提供的各型Soat2条件敲除小鼠肝脏脂肪变性情况指出，小肠Soat2缺失小鼠肝脏脂肪变性较轻(肠敲与全敲小鼠)。而，单纯肝脏丧失Soat2(肝敲小鼠)，虽然降低胆固醇酯，但依旧带来甚至加重甘油三酯(TG)蓄积(图3，4，5)。表明即使肝脏Soat2正常存在，小肠Soat2丧失足以抵抗饮食导致的脂肪肝。其关键性机制可能是由于肠道Soat2的缺失促进了脂肪酸转运蛋白CD36的泛素化降解，从而降低了外源性脂肪酸的摄入。因此，本专利技术提供了所述药物靶点Soat2蛋白。
[0012]Soat2作为靶点在筛选治疗脂肪肝的药物中的应用。
[0013]一种降脂药物筛选模型，为稳定表达Soat2蛋白的结肠癌细胞Caco2。
[0014]一种筛选降脂药物的方法，包括首先选择稳定表达Soat2蛋白的肠上皮细胞Caco2，皿中接种细胞后24h，添加化合物，培养一定时间后，采用高通量NBD
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cholesterol筛选、PCR以及BODIPY
TM FL C
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荧光来确定Soat2蛋白的量。NBD
‑
cholesterol提示Soat2活性改变，PCR提示Soat2相对表达量，BODIPY
TM FL C
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提示游离脂肪酸摄取情况，若上述结果出现降低，则表明化合物能抑制肠道Soat2的表达及活性。
[0015]本专利技术提供利用上述药物筛选模型筛选以肠道Soat2蛋白为靶点的降脂药物的方法：
[0016]A.利用高通量筛选分析检测NBD
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cholesterol荧光强度，对所有目标药物进行初筛：细胞接种于96孔板后，向培养液中加入初筛选出的药物，同时以空白试剂作为对照组，Soat2特异性抑制剂PPPA，完全抑制细胞中Soat2活性后，作为背景值，孵育一段时间后，加入NBD
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cholesterol进行孵育。弃掉培养液，冷PBS洗涤2遍，使用酶标仪检测荧光强度(激发
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Soat2作为靶点在筛选抑制肠道脂肪酸摄取的药物中的应用。2.Soat2作为靶点在筛选降脂药物中的应用。3.Soat2作为靶点在筛选治疗脂肪肝的药物中的应用。4.Soat2作为靶点在筛选治疗肥胖的药物中的应用。5.一种降脂药物筛选模型，其特征在于所述的模型为稳定表达Soat2蛋白的结肠癌细胞Caco2。6.一种筛选降脂药物的方法，其特征在于包括：首先选择稳定表达Soat2蛋白的肠上皮细胞Caco2，皿中接种细胞后20～26h，添加待筛选物质，培养一定时间后，采用高通量NBD
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cholesterol筛选、PCR以及BODIPY
TM
FL C
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荧光来确定Soat2蛋白的量；NBD
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cholesterol提示Soat2活性改变，PCR提示Soat2相对表达量，BODIPY
TM
FL C
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提示游离脂肪酸摄取情况，若上述结果出现降低，则表明该物质能抑制肠道Soat2的表达。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于包含以下步骤：(1)利用高通量筛选分析检测NBD
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cholesterol荧光强度，对所有目标药物进行初筛：细胞接种于...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾爱华，蒋兆彦，邵文涛，梁静佳，刘倩，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：