一种联合药物筛选的方法技术

本发明专利技术属于药效分析及药物筛选领域，公开了一种联合药物筛选的方法。步骤为微流控芯片制作、微流控芯片培养细胞、单因素药物筛选、联合药物药效筛选、药物载体设计及筛选。利用这种联合药物筛选的方法可根据需要选择不同药物剂量及组合方式，在更早期阶段获得药物对细胞产生的联合效应的详细数据，从而显著提高发现研究对象的速率，同时极大地节省的新药开发费用，方法设计小巧简单，检测方法稳定快速，便于产业化。于产业化。

【技术实现步骤摘要】
一种联合药物筛选的方法


[0001]本专利技术属于药效分析及药物筛选领域，具体涉及一种联合药物药效的检测和分析方法的建立。

技术介绍

[0002]在恶性肿瘤的治疗中，对于术后预防复发，易转移的肿瘤，无法进行手术的病例等，化疗是最重要的治疗手段。但是，往往由于药物的毒副作用以及耐药性，化疗效果不尽如人意。因此，增强化疗药物的靶向性，降低毒副作用，减少耐药性，是化疗方案制定的核心问题，也是难点。
[0003]随着生命科学及计算机科学的快速发展，药物发现进入基于靶点的时代。虽然在药物发现中使用了许多新技术，但药物发现效率并没有如人们期待的那样大幅提高，药物毒性及耐药性是提高药物发发现效率的主要限制因素。因此药物发现的关键除了尽快找到合适的靶点以外，还需要应用高通量药物筛选技术找到更低的有效药物浓度或联合用药，以尽可能降低药物毒性。
[0004]联合用药在恶性肿瘤的化疗中已有应用，但目前存在的问题是对于肿瘤的异质性、高突变应对不足或不及时，疗效有限。联合药物治疗作用于多个靶点和细胞亚群，可相互增强治疗效果并减少副作用和延缓或防止耐药性。目前临床大多数联合疗法都是经验性开发的，很少有实验研究旨在使用适当的分析方法来彻底探索不同的药物组合。由于多种药物联合使用彼此之间的影响不明确，所以联合药物在临床评估之前，必须测试组合的效力，以防止拮抗作用、毒副作用对人体的伤害。
[0005]目前联合药物药效测试主要是依赖细胞毒、细胞活力检测(CN202010672102、 CN201110306875、CN201520645741、DOI:10.11954/ytctyy.201907060)、动物模型测试 (CN201910790508、CN201811587087、CN201810387270)、病例分析(CN201710295893、CN201711286033)。
[0006]细胞周期是细胞增殖最直观的体现，更是生命活动的基本过程，在各种基于细胞的检测中，细胞周期分析在生物学研究和临床应用中都有着重要的作用。尤其肿瘤细胞以其无限繁殖能力为典型代表，遏制其细胞周期可有效组织肿瘤细胞的增殖及扩散。目前，大多数细胞周期药物分析大都依赖于流式细胞术(CN01133652、CN200810136601、 CN202010177706、DOI:10.1016/j.bbrc.2019.08.163、DOI:10.1016/j.fct.2018.06.024)，少部分利用一些其他方法如免疫组化、蛋白印迹等分析细胞周期相关蛋白(DOI: 10.1080/10715762.2020.1805447、DOI:10.3390/ht7020018)。虽然流式细胞术被认为是一种成熟的单细胞模式细胞周期分析工具，但其高检测成本、低检测量、大样本体积以及缺乏现场监测能力限制了该技术更广泛的应用。为了进一步提高检测效率和降低检测成本，迫切需要细胞检测的小型化、集成化和自动化。
[0007]在前期工作中我们建立了一种基于微流控芯片精确分析细胞周期的方法 (CN201910033968)，在此基础上我们开发了其在联合药物药效筛选中的应用。需要说明的
1％青霉素或链霉素的DMEM培养基中，放置在5％CO2，37℃培养箱中，当细胞汇合度达到80％时将细胞用胰酶消化后从芯片进样端分别灌入用含30％FBS的培养基浸泡超过24h的芯片中，放置在5％CO2，37℃培养箱中培养。
[0017]进一步的，所述步骤3、4、5中使用的单因素药物及浓度分别为：紫杉醇： 20nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L；秋水仙碱：10nmol/L、 50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L；苦参碱：0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、 1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L；喜树碱：0.15μmol/L、0.3μmol/L、1.5μmol/L。
[0018]本专利技术与现有技术相比的有益效果是：1.可根据需要选择不同药物剂量及组合方式，除此之外还可测试药物载体及官能团的效果，适合大批量筛药的同时及快速检测，同时药物的多重组合及优化也显著降低了药物的细胞毒性；2.可以在更早期阶段获得药物对细胞产生的联合效应的详细数据，从而显著提高发现研究对象的速率，同时极大地节省的新药开发费用；3.本专利技术方法设计小巧简单，检测方法稳定快速，便于产业化。
附图说明
[0019]图1是本专利技术新型联合筛药流程示意图：(A)微流控芯片图像；(B)根据单因素分析进行药物正交实验设计；(C)培养细胞后加入设计的药物，药物影响细胞周期从而导致DNA含量发生变化；(D)通过4'
‑6‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚(DAPI)染色获得核酸DNA的荧光图像；(E)转换成核酸染色的荧光强度并得到不同荧光强度下细胞数的直方图；(F)分析正交实验数据，得到最佳药物组合及剂量。
[0020]图2是在Nikon Eclipse Ti倒置荧光显微镜下获得的正常组与单独药物处理后的 Hela细胞细胞周期示意图：(A)紫杉醇；(B)秋水仙碱；(C)苦参碱；(D)喜树碱。白色：G0/G1期；灰色：S期；黑色：G2/M期。
[0021]图3是在Nikon Eclipse Ti倒置荧光显微镜下获得的正常组与正交试验不同药物剂量及组合对Hela细胞周期的影响示意图。白色：G0/G1期；灰色：S期；黑色：G2/M期。图4是正交试验筛选出的最佳联合药物及葫芦脲和精胺处理对Hela细胞周期的影响周期图。白色：G0/G1期；灰色：S期；黑色：G2/M期。
具体实施方式
[0022]下面通过具体实施例详述本专利技术，但不限制本专利技术的保护范围。如无特殊说明，本专利技术所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
[0023]实施例1
[0024]基底修饰及芯片制作
[0025]将选择的基底按合适大小进行化学修饰切割并在背面做好标记(经过多聚赖氨酸处理的载玻片)；反应池的数量、形状、尺寸可根据需要设计。采用AutoCAD 2014软件设计微流控芯片图纸，其孔道大小为9mm(l)
×
2mm(w)
×
0.2mm(h)，并利用排照机将图纸打印为掩膜版。在洁净的硅片表面旋涂光刻胶，调整旋涂机的转速为2000r/min，使光刻胶的厚度为200μm，置于95℃烤胶机上烘烤，冷却备用。将上述硅片置于掩膜版下方，放置在波长为280nm的紫外光下曝光。将硅片在95℃烤胶机上烘烤，后缓慢降至室温。随后，将降至室温的硅片取下，放置于玻璃培养皿中，加入显影液，轻微震荡至图形清晰可见，用丙酮去除硅片
上残留的显影液，最后用去离子水清洗去除残留丙酮；将完成的硅片放置于培养皿内室温晾干。将硅片置于合适大小的铝模板中，在其上浇注质量比A:B＝8:1的PDMS混合溶液，将其放入真空干燥器中负压抽净PDMS中混合的溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种联合药物筛选的方法，其特征在于，具体步骤为：(1).微流控芯片制作：按质量比A：B＝5～10：1制备PDMS芯片，制作好的芯片通过连接剂连接到经过多聚赖氨酸处理的载波片上，其中A液为聚二甲基硅氧烷单体，B液为引发体；(2).微流控芯片培养细胞：样品细胞培养在培养基并将培养基放置在培养箱中，当细胞汇合度达到80％时将样品细胞用酶消化后置入所述步骤1中修饰基底的微流控芯片中，将芯片放置在培养箱中培养；(3).单因素药物初筛：单因素药物用培养基配置成浓度梯度的溶液并分别作用于细胞不同时间后固定并分析细胞周期；分析方法为：用具有电荷耦合器件相机的倒置荧光显微镜获得经染色的荧光细胞图像并测量所选区域的荧光强度，将荧光的整合强度转换为间隔为60的频率计数，绘制直方图用以反映相对积分强度下的细胞计数，并与对照组实验参数比较，分析药物生物活性并确定合适的作用剂量及时间；(4).联合药物药效筛选：基于药物单因素分析结果选择合适的药物种类及浓度，并根据L
n
(m
k
)设计实验，筛选联合药物最佳组合，染色分析方法与所述步骤3相同，同时正交试验数据进行极差和...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晶，郎明非，康秀芝，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：