一种含Fc结构域的新型冠状病毒S蛋白受体结合域融合蛋白及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种新型冠状病毒(SARS

【技术实现步骤摘要】
一种含Fc结构域的新型冠状病毒S蛋白受体结合域融合蛋白及其用途


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种新型冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)受体结合域(RBD)融合蛋白，及由其形成的寡聚体，以及RBD融合蛋白或RBD融合蛋白寡聚体在制备预防新型冠状病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗中的用途。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)为有包膜的正链RNA病毒，病毒有4种结构蛋白(S、M、N、E)，其中S蛋白是感染入侵的关键蛋白，以三聚体形式分布在包膜表面，其N端含有细胞受体结合域(receptor binding domain,RBD)。RBD与宿主细胞的ACE2结合后，S蛋白发生变构，启动病毒感染入侵。S蛋白是冠状病毒疫苗研究的主要靶抗原。
[0003]Moderna及辉瑞的以S蛋白为基础的mRNA新冠疫苗的III期临床试验的中期结果显示，两种疫苗的保护效率均在90％以上，表明S蛋白作为疫苗抗原可成功地预防病毒的感染，且具有很好的安全性。包括上述两家公司在内的多家制药公司的S蛋白抗原都进行了突变修饰，在S2区域引入了2P突变，使S蛋白处于融合前的状态，以保证S蛋白中与ACE2受体结合的区域(RBD区)以正确的构象进行最大程度的暴露。因此，以RBD为基础的新冠疫苗备受关注，包括流感病毒载体疫苗、RBD蛋白疫苗等。新冠病毒RBD蛋白疫苗目前报道的有两种形式，分别是RBD单体疫苗及两个拷贝的RBD串联形成的二聚体疫苗，其中串联二聚体疫苗具有较强的诱发产生中和抗体的活性，其诱发产生中和抗体的滴度是康复者血清的3.9倍，较目前报道的其他形式的新冠疫苗，包括灭活疫苗、mRNA疫苗、腺病毒载体疫苗，均较高。因此，新冠病毒RBD蛋白疫苗具有研发前景。
[0004]RBD蛋白疫苗首先是以单体的形式在SARS
‑
CoV中进行探索研究的。采用酵母表达体系进行SARS
‑
CoV RBD单体的研究，选择了两种长度的RBD(aa.318
‑
510/193mer、aa.318
‑
536/219mer)及其3种敲除或突变不同N糖基化位点(N1、N2、N3)的RBD突变体，发现所有的去糖基化修饰均可显著降低RBD突变体的表达水平，其中N1糖基化位点(aa.318)的影响相对较小，对N1去糖基化位点突变体及野生型RBD的免疫血清的中和活性进行分析，发现：首先，去糖基化位点的修饰可增强219mer的免疫原性，但是降低了193mer的免疫原性；其次，两种长度的RBD，在N1位点去糖基化修饰的状态下，219mer高于193mer，而糖基化位点正常的野生型状态下，两者相同。上述结果表明，在酵母表达体系中，3种去糖基化修饰可降低RBD的表达量，N1去糖基化位点的修饰对RBD免疫原性的影响与RBD的长度相关，去糖基化修饰的突变体中，219mer的免疫原性较好。由于酵母是单细胞真核生物，其糖基化形成的支链寡糖，特别是最末端的寡糖类型具有酵母种属的特点，与多细胞真核生物来源的表达体系，如昆虫细胞、293T细胞等的糖基化类型及支链寡糖的构成特点具有明显不同。糖基化的不同不仅可影响其表观分子量，同时也可影响蛋白的整体理化性质。目前，有关去糖基化的RBD突变体在其他表达体系中，去糖基化对RBD的表达水平及免疫原性的影响未见报道。
[0005]MERS RBD
‑
Fc融合蛋白的研究发现，以RBM为核心区，分别向N端和/或C端延长，获
得的5种不同长度的RBD(aa.350
‑
588、aa.358
‑
588、aa.367
‑
588、aa.367
‑
606、aa.377
‑
588)
‑
Fc融合蛋白，免疫血清针对MERS
‑
CoV的中和实验分析显示，RBD(aa.377
‑
588)
‑
Fc的中和活性显著高于其他4个RBD突变体
‑
Fc，而其他4个突变体之间的中和活性无差异。提示免疫原性最高的MERS
‑
CoV RBD肽段是不可预测的。目前，SARS
‑
CoV RBD
‑
Fc融合蛋白的研究仅报道了一种长度的RBD区(aa.318
‑
510)，新冠病毒RBD蛋白疫苗研究以RBD单体及串联二聚体为主，其RBD
‑
Fc融合蛋白疫苗也仅报道了一种长度的RBD区(aa.319
‑
532)。因此，新冠病毒RBD
‑
Fc融合蛋白疫苗的研究中，免疫活性最佳的RBD长度是无法预测的。另外，采用两个拷贝的免疫原性最高的RBD串联肽，在其C端融合Fc或其他寡聚化结构域，进行RBD四聚体、六聚体等蛋白疫苗的研究，尚未见有报道。
[0006]因此，本专利技术利用昆虫细胞表达体系，采用表达新冠病毒RBD
‑
Fc融合蛋白的方法，获得不同长度、不同糖基化修饰、不同拷贝数RBD、含或不含分子内佐剂的Fc
‑
RBD多聚体融合蛋白疫苗，包括Fc
‑
RBD二聚体及Fc
‑
RBD四聚体，优选免疫活性最佳的Fc
‑
RBD多聚体蛋白疫苗题。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种新型冠状病毒RBD融合蛋白及其形成的寡聚体，用于制备预防新型冠状病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗。
[0008]本专利技术人出人意料地发现，不同长度的RBD多肽、不同的糖基化修饰、不同的寡聚化结构域，均可显著影响RBD融合蛋白的表达水平及免疫活性，通过对多个候选RBD融合蛋白进行筛选，本专利技术获得了在昆虫细胞表达系统中高水平表达、并可诱发针对新型冠状病毒的中和抗体的RBD融合蛋白及其寡聚体。
[0009]基于上述目的，本专利技术提供了一种新型冠状病毒S蛋白受体结合域融合蛋白，其特征为，含有至少一个拷贝的源自新型冠状病毒S蛋白或S蛋白突变体的RBD多肽、寡聚化结构域、和/或内源性佐剂。
[0010]可选地，本专利技术涉及的新型冠状病毒S蛋白的氨基酸序列来自NCBI数据库中的QHD43416.1序列，新型冠状病毒S蛋白突变体序列可来自但不限于Alpha、Beta、Gamma、Delta、Epsilon、Eta、Iota、Kappa、Lambda、Zeta、Mu等新型冠状病毒变异株的S蛋白(如NCBI数据库中的QWA53375.2、QWA53387.1、QVI56963.1、QWM26437.1序列等)。优选地，所述的新型冠状病毒S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0011]可选地，所述S蛋白突变体为将其RBD区域的N糖基化或O糖基化位点删除或置换的突变体。优选地，所述删除或置换突变为将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位、和/或第343位、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒S蛋白受体结合域(RBD)融合蛋白，其特征为，含有至少一个拷贝的源自新型冠状病毒S蛋白或S蛋白突变体的RBD多肽、Fc结构域、和/或内源性佐剂，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述Fc结构域为人IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4的Fc结构域，所述Fc结构域融合在所述RBD多肽的C端，所述内源性佐剂为RS09佐剂，所述内源性佐剂融合在所述RBD多肽的N端和/或所述Fc结构域的C端，所述RBD多肽之间和/或所述RBD多肽及Fc结构域之间用连接子进行连接。2.一种如权利要求1所述的RBD融合蛋白，其特征为：所述连接子由0至17个柔性氨基酸构成，所述柔性氨基酸选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、脯氨酸(P)及苏氨酸(T)；所述RBD多肽来自新型冠状病毒S蛋白或S蛋白突变体，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述S蛋白突变体的氨基酸序列选自：将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位、和/或第343位、和/或第354位、和/或第360位的天冬氨酸(N)删除或置换为非极性氨基酸或极性不带电荷氨基酸，所述非极性氨基酸或极性不带电荷氨基酸选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)及苏氨酸(T)；将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位、和/或第343位、和/或第354位、和/或第360位的天冬氨酸(N)删除或置换为非极性氨基酸或极性不带电荷氨基酸，和/或将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)和/或将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第614位天冬氨酸(D)置换为甘氨酸(G)，所述非极性氨基酸或极性不带电荷氨基酸选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)及苏氨酸(T)。3.一种如权利要求2所述的RBD融合蛋白，其特征为，所述RBD多肽来自SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或所述S蛋白突变体序列的319至537位，或其N端延长或截短1至13个氨基酸、和/或C端截短1至13个氨基酸或延长1至82个氨基酸的序列，所述Fc结构域的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或SEQ ID No.2所示序列的突变体，所述RS09佐剂的序列为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。4.一种如权利要求3所述的RBD融合蛋白，其特征为，所述Fc结构域的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或SEQ ID No.2所示序列的突变体，所述RS09佐剂的序列为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，所述RBD多肽选自：SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位至550位；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第332位至550位；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至591位；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至614位；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位至550位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第332位至550位，且第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位；且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至591位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至614位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(...

【专利技术属性】
技术研发人员：许雪梅，王志荣，张婷，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：