一种结肠癌生物标志物及其应用制造技术

本发明专利技术属于肿瘤分子诊断技术领域，具体涉及一种结肠癌生物标志物及其应用，本发明专利技术经研究发现，结肠癌患者的外泌体可稳定表达ENTPD2，其表达水平明显高于健康人，且较高水平的外泌体ENTPD2与患者TNM分期和肿瘤浸润深度密切相关，说明血清外泌体ENTPD2在结肠癌诊断中具有明显的优势，有望成为结肠癌筛查、个体化治疗及预后监测的新型生物学标志物，为结肠癌的治疗提供了新的方向。本发明专利技术首次发现了ENTPD2在结肠癌组织中明显高表达，且其表达水平与患者的预后密切相关，并证明了ENTPD2可有助于结肠癌患者的早期诊断以及预后判断。助于结肠癌患者的早期诊断以及预后判断。助于结肠癌患者的早期诊断以及预后判断。

【技术实现步骤摘要】
一种结肠癌生物标志物及其应用


[0001]本专利技术属于肿瘤分子诊断
，具体涉及一种结肠癌生物标志物及其应用。

技术介绍

[0002]结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤，全球CRC总体发病率位于第3位。CRC发病隐匿，多数患者发现时已处于中晚期，绝大部分患者因此失去了最佳的治疗时机。因此深入研究CRC的发生与发展机制，从中筛选出具有价值的诊断标志物将有助于在预防、诊治和预后治疗等环节中为临床决策提供参考。
[0003]精准医学在肿瘤诊断和治疗中发挥着重要的作用。其中，液体活检作为传统活检的替代技术，通过非侵入性的取样方式获得肿瘤信息，辅助肿瘤患者的治疗，是精准医学代表性的诊断技术。目前，肿瘤的液体活检根据体液中的成分来源可分为三种：即循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)以及肿瘤来源外泌体。由于ctDNA及CTC在血液中含量低，收集和纯化的方法复杂，所以存在一定的弊端，同时，组织活检需要专业临床医师进修取材处理且具有创伤性。而外泌体作为新兴的液体活检靶标，在血液、尿液等的体液中较为稳定，具有良好的应用前景。
[0004]2013年的诺贝尔生理或医学奖授予研究细胞内囊泡/外泌体运输调控机制的3位科学家，将外泌体研究推向了前所未有的新高潮。外泌体在近些年的研究历程中，也从基础研究走到了临床应用阶段。2016年世界首个肿瘤外泌体诊断试剂盒ExoDx Lung(ALK)由Exosome Diagnostics公司推出，用于检测非小细胞肺癌患者的EML4
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ALK突变。此后该公司的ExoDx Prostate(EPI)试剂盒被批准用于诊断前列腺癌，并且这一基于外泌体的液体活检方法已被纳入国家综合癌症网络指南中，被批准用于前列腺癌的早期筛查。然而，目前外泌体用于肿瘤诊断还处在早期发展阶段，仍然需要有价值的基础科研成果来指导临床应用。
[0005]液体活检作为一种新兴的手段，可取材于血液、尿液等体液，创伤性很小且利于肿瘤患者的实时监控。作为液体活检的三大手段之一，外泌体是由供体细胞经胞吐作用释放到细胞外的脂质双层囊泡，作为细胞间信号传导的重要载体，外泌体携带丰富的可检测物质(mRNA、DNA、miRNAs及蛋白质等)。外泌体用于液体活检具有以下优势：(1)含量丰富，如在血液中每毫升可有1
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109个外泌体；(2)通透性强，容易存在于各种体液中，是液体活检的前提条件；(3)稳定性高，外泌体的脂质双层结构可对包含的内容物有保护作用。越来越多的研究表明，外泌体中的多种蛋白质在肿瘤的早期诊断中具有重要作用。例如在胰腺导管癌和CRC患者的循环外泌体中，GPC1表达水平明显升高，外泌体源性GPC1可作为消化系统肿瘤的早期检测工具。也有研究通过检测血浆来源的外泌体，发现CD151、CD171和tetrasppanin 8可以作为肺癌患者的诊断标志物。外泌体可简便地从体液中收集，并且其分析相对简单，因此外泌体中的蛋白质分析具有成为早期结肠癌筛查新型生物标志物的潜力。
[0006]肿瘤细胞及其所处的微环境对肿瘤的发生发展至关重要，肿瘤细胞和免疫细胞密
切接触释放多种免疫调节性的因子，可形成具有强烈免疫抑制作用的微环境。目前已有多项研究表明，ATP
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腺苷通路在肿瘤微环境免疫抑制反应中扮演了重要的角色。其中胞外二三磷酸核苷酸水解酶(ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase,ENTPD)家族成员可以将ATP水解为AMP/ADP，是参与产生免疫抑制性腺苷过程中的关键限速酶。ENTPD2是细胞膜上的核苷酸水解酶，来自肿瘤细胞的外泌体可特异性地包裹细胞膜表面蛋白质。
[0007]在正常生理状态下，ATP主要位于细胞膜内，而细胞外处于很低的水平。当处于肿瘤微环境中时，细胞内的ATP会大量释放到细胞外引起免疫反应。细胞外的ATP会被ENTPD家族水解转化为ADP和AMP，AMP再在CD73的催化下生成免疫抑制性的腺苷，腺苷是调节固有免疫和适应性免疫的关键性效应分子，具有重要的免疫抑制作用。有研究发现ENTPD1(CD39)在肾、肺、甲状腺、卵巢、胰腺等肿瘤中的表达水平显著升高，然而与正常组织相比，结肠癌组织和细胞中的ENTPD1表达量并无统计学意义。目前尚未有研究关注ENTPD家族中其他成员在结直肠癌中扮演的角色。在ENTPD家族中，ENTPD 1、2、3和8位于细胞表面，并呈现一个面向细胞外空间的催化位点。
[0008]因此，内含于外泌体的ENTPD2分析有望作为早期肿瘤筛查的生物标志物。然而，ENTPD2在结肠癌微环境中的生物学作用及其在结肠癌中的诊断价值尚未得到研究。

技术实现思路

[0009]为了克服上述现有技术的不足，本专利技术经研究发现，外泌体ENTPD2有望成为结肠癌筛查、个体化治疗及预后监测的新型生物学标志物。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0011]本专利技术提供了一种结肠癌生物标志物，所述生物标志物为ENTPD2。
[0012]优选地，所述生物标志物为外泌体ENTPD2。进一步地，所述生物标志物为血清外泌体ENTPD2。
[0013]优选地，所述生物标志物可用于指示早期结肠癌。
[0014]优选地，所述生物标志物可用于结肠癌的预后判断。
[0015]相比于检测组织中的ENTPD2水平，检测患者外周血外泌体中ENTPD2的表达水平创伤性更小，因此探讨外泌体中的ENTPD2水平具有成为结肠癌筛查标志物的潜力。外泌体不仅仅是单纯的细胞脱落碎片，其携带有多种来源于供体细胞(如肿瘤细胞)的内容物，然而细胞膜蛋白ENTPD2在肿瘤来源的外泌体中是否表达尚无研究证实，为此，本专利技术提取了结肠癌细胞系来源的外泌体，以探讨外泌体中ENTPD2的水平，并分别通过电子透射显微镜、Nano
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tracker检测和流式检测等方法对外泌体的标记蛋白进行鉴定，进一步通过Western blotting检测发现结肠癌细胞来源的外泌体除了含有Alix、TSG101、CD9等标记性蛋白外，也高表达ENTPD2。
[0016]同时，本专利技术选取28例结肠癌患者和9例健康对照者作为研究对象，对提取的血清来源外泌体内的蛋白进行分析后发现，结肠癌组的外泌体可稳定表达ENTPD2，其表达水平明显高于健康对照组。进一步研究还发现，较高水平的外泌体ENTPD2与患者TNM分期和肿瘤浸润深度密切相关。综上所述可见，血清外泌体ENTPD2在结肠癌诊断中具有明显的优势，有望成为结肠癌筛查、个体化治疗及预后监测的新型生物学标志物。
[0017]本专利技术还提供了上述的结肠癌生物标志物在制备结肠癌诊断和/或预后判断产品
的中的应用。
[0018]优选地，所述产品包括但不限于试剂盒、试剂、检测仪器。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结肠癌生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为ENTPD2。2.根据权利要求1所述的一种结肠癌生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为外泌体ENTPD2。3.根据权利要求2所述的一种结肠癌生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为血清外泌体ENTPD2。4.根据权利要求1所述的一种结肠癌生物标志物，其特征在于，所述生物标志物可用于指示早期结肠癌。5.根据权利要求1所述的一种结肠癌生物标志物，其特征在于，所述生物标志物可用于结肠癌的预后判断。6.权利要求1
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5任一项所述的结肠癌生物标志物在制备结肠癌诊断和/或预后判断产品的中的应用。7.一种用于结肠癌诊断...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘焕亮，石梦辰，杨湘玲，贾会真，韦丽丽，张瀞丹，田宇，
申请(专利权)人：中山大学附属第六医院，
类型：发明
国别省市：