一种基于单颗粒电感耦合等离子体质谱的多组分均相免疫分析方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种基于单颗粒电感耦合等离子体质谱（spICPMS）的多组分均相免疫分析方法，通过同时对三种贵金属纳米颗粒混合探针（CA125

【技术实现步骤摘要】
一种基于单颗粒电感耦合等离子体质谱的多组分均相免疫分析方法


[0001]本专利技术属于化学领域，涉及单颗粒电感耦合等离子体质谱(Single Particle Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，spICPMS)的分析化学传感领域，特别涉及一种基于单颗粒电感耦合等离子质谱的多组分均相免疫分析用于胰腺癌相关的三种特异性抗原标志物的血清评估。

技术介绍

[0002]胰腺癌是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，由于缺乏简便、敏感的诊断方法和特异性的生物标志物，其预前诊断和术后复发预测一直是一个难题。联合生物标志物分析策略为克服这种困境提供了有希望的解决手段，但仍需要在方法学方面进行发展，以在无需清洗或分离的条件下获得准确可靠、干扰最小的结果。本文提出了一种能同时检测三种胰腺癌相关生物标志物的单颗粒均相免疫分析方法。单颗粒电感耦合等离子体质谱法（spICPMS）由于具有良好的分辨率和多元素检测器而不存在质谱重叠的优势，由特异性抗体标记的贵金属纳米粒子（金纳米颗粒（AuNPs），银纳米颗粒（AgNPs）和铂纳米颗粒（PtNPs））作为探针，同时为生物标志物（糖类抗原125（CA125）、癌胚抗原（CEA）和糖类抗原（CA199））提供了三到四个数量级的线性范围和低水平检测限（LODs）。通过同时对spICPMS的强度信号和频率信号进行分析，该方法成功地应用于患者的血清评估，其得出的结果与临床常规方法测定结果吻合良好。结合多种生物标志物联合预前诊断策略，该方法有可能成为胰腺癌预前诊断和复发风险评估的有用工具。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种基于单颗粒电感耦合等离子体质谱（spICPMS）的多组分癌症标志物分析方法，及其在对胰腺癌相关癌症标志物血清检测方面的应用。
[0004]本专利技术的原理是：本方法基于分析物诱导纳米颗粒聚集的原理。当修饰有特异性癌症标志物（含三种，即CA125、CEA和CA199）抗体的贵金属纳米颗粒（含三种，即Au、Ag和Pt）探针与含有的癌症标志物抗原的样品混合时，贵金属探针对抗原靶点的结合导致三种纳米颗粒形成聚合物。这种由抗原抗体特异性识别诱导的纳米颗粒聚集导致探针聚合物数量减少和聚合物尺寸增加，从而引起单个贵金属纳米颗粒聚合物的频率和强度变化。通过spICPMS的频率和强度两种模式同时对三种贵金属纳米颗粒聚集变化进行测定，即实现对于三种抗原的同时测定。两种模式可提高样品检测的准确度。
附图说明
[0005]本专利技术采用的基于分析物诱导贵金属纳米颗粒聚集的原理，凭借无机质谱高分辨的质荷比信号区分的优势，实现均相体系中对三种贵金属同时检测以达到对三种胰腺癌相关抗原的同时分析
图1 为本专利技术分析方法的机理图；图2为本专利技术分析方法中三种贵金属纳米颗粒电子显微镜表征图和混合探针的信号区分图；图3 为本专利技术分析方法中spICPMS在三组分均相免疫分析中的时间分辨数据图；图4 为本专利技术分析方法中spICPMS两种模式对三种贵金属在三种抗原检测中的线性图；图5 为本专利技术分析方法中混合探针的干扰分析图；图6 为本专利技术分析方法在血清中检测的应用图。
具体实施方式
[0006]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用到的水均为超纯水，经Milli-Q超纯水净化系统处理而成。
[0007]本专利技术按以下具体步骤进行。
[0008]a. 29.5 nm AuNPs的制备a1取2 mL 1%氯金酸（w/v）加入到60 mL超纯水中，在三口瓶中放入磁子混匀，在加热套中回流加热至沸保持温度15 min；a2 加入1.3 mL的1%柠檬酸钠还原剂，搅拌下保持回流30 min；a3 关闭加热套温控系统，保持搅拌子搅拌，待溶液缓慢降温至室温，倒出溶液至100 mL储备瓶中，定容至100 mL。
[0009]b. 32.1 nm AgNPs的制备b1 取20 mL 1%柠檬酸钠还原剂加入到75 mL超纯水中，在三口瓶中放入磁子混匀，在加热套中回流加热至70 o
C并保持15 min；b2 接着，1.7 mL 1% AgNO3被加入到溶液中，随后迅速加入2 mL 0.1% (w/v)新制的NaBH4溶液；b3 反应保持在70 o
C下1 h，随后慢慢降至室温。种子溶液被定容到100 mL并储存与4 o
C下以备用；b4 2 mL 1%柠檬酸钠还原剂与75 mL超纯水混合并用加热套加热至沸保持15 min；b5 10 mL种子溶液加入，紧接着加入1.7 mL 1% AgNO3，溶液加热搅拌回流1 h；b6 2 mL 1%柠檬酸钠还原剂与1.7 mL1% AgNO3被加入到反应液中，反应持续1 h；b7 2 mL 1%柠檬酸钠还原剂与1.7 mL1% AgNO3被加入到反应液中，反应持续1 h，制备出第二阶段种子溶液，取出定容后4 oC
下保存备用；b8 2 mL 1%柠檬酸钠还原剂与80 mL超纯水混合并用加热套加热至80 o
C保持15 min；b9 10 mL第二阶段种子溶液加入，紧接着再加入1.7 mL 1% AgNO3，溶液保持80 o
C搅拌回流2 h，缓慢冷却至室温，取出Ag纳米颗粒，定容后4 o
C下保存备用。
[0010]c. 37.3 nm PtNPs的制备c1 1%氯铂酸与超纯水混合在三颈烧瓶中，加热套加热至沸并保持15 min；c2 随后加入1.1 mL 1%柠檬酸钠还原剂与0.05% 柠檬酸的混合溶液，紧接着继续加入0.55 mL 1%柠檬酸钠还原剂，0.05%柠檬酸与0.08～0.11%的KBH4混合溶液；
c3 关闭加热套加热系统，让混合溶液缓慢降至室温，取出种子纳米颗粒溶液并定容；c4 将56 mL超纯水与2 mL种子溶液混合，加入1%氯铂酸溶液1.8 mL，随后加入1 mL 1%柠檬酸钠还原剂与1.25%抗坏血酸溶液的混合溶液；c5 缓慢升温至沸，保持15 min，将第二阶段的种子溶液取出并定容；c6 将56 mL超纯水与2 mL第二阶段种子溶液混合，加入1%氯铂酸溶液1.8 mL，随后加入1 mL 1%柠檬酸钠还原剂与1.25%抗坏血酸溶液的混合溶液；c7 缓慢升温至沸，保持15 min，将Pt纳米颗粒溶液取出并定容备用。
[0011]d. 贵金属纳米颗粒标记d1 取1 mL AuNPs，先加入100 μL pH 9.0的硼酸缓冲溶液，调节pH大约至8.0-8.4左右，使得纳米颗粒pH在抗体等电点附近（自身不带电荷），用涡旋混匀；d2 加入40 μg CA125抗体，涡旋混匀，在室温（25℃）下反应30 min；d3 加入封闭剂10 %的BSA溶液130 uL，在室温（25℃）下封阻30 min；d4 反应后溶液在4
o
C下离心（10000 rpm）18 min，吸去上清之后，浓缩液溶解于含1% BSA的PBS缓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于单颗粒电感耦合等离子体质谱的多组分均相免疫分析方法，其特征在于：所述分析方法包括三种贵金属抗体功能化的纳米颗粒探针（CA125标记AuNPs，CEA标记AgNPs和CA199标记PtNPs），在对应抗原存在下，可基于抗原抗体特异性识别诱导贵金属纳米颗粒探针聚集，通过单颗粒电感耦合等离子体质谱（spICPMS）同时对抗原进行定量检测。2.如权利1所叙述的免疫方法，其特征在于，体系采用在pH 7.4的PBS缓冲溶液（0.01M pH 7.4，含137 mM NaCl和2.7 mM KCl）中进行，发明方法通过静电吸附的方式对贵金属纳米颗粒进行标记，每1 mL AuNPs溶液中加入40 μg CA125抗体对AuNPs进行修饰，每1 mL AgNPs溶液中加入40 μg CEA抗体对AgNPs进行修饰，每1 mL PtNPs溶液中加入40 μg CA199抗体对PtNPs进行修饰，探针纯化的离心条件为在4 o
C下以10000 rpm的速度离心18 min，吸去上清液，重溶于PBS中。3.修饰上特异性抗体的贵金属纳米颗粒探针，对于相应抗原存在的血清样...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘睿，黄自立，吕弋，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：