一种以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法技术

本发明专利技术公开了一种以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法。本发明专利技术以癌胚抗原（CEA）为研究模型，磁珠为载体，金纳米颗粒为报告探针。采用高分辨电感耦合等离子体质谱（ICPMS）同时采集磁珠内的

【技术实现步骤摘要】
一种以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及免疫分析，比率分析方法及稳定同位素(Metal stable isotope)传感领域。

技术介绍

[0002]磁珠（MPs）通常是由γ-Fe2O3或Fe3O4组成的微球，其大小可以从纳米到微米级别。独特的超顺磁性避免了离心和色谱分离等费时费力的分离程序，促使磁性微球是世界上商业化应用最广泛的基底。磁珠在癌症治疗，药物输送，磁共振成像，血液净化和分子诊断等各种生物学应用中均取得了巨大的成功。例如，基于磁性微球开发了具有光热和磁热特性的近红外MPs成像示踪剂被用于小鼠的肿瘤消融。以及创建了基于MPs的体外血液净化设备，用于治疗血液中毒，在无需识别传染源的情况下实现对血液中的病原体和毒素的不断清除。除此之外，一些基于磁珠的特异性强、灵敏度高、无放射性污染的生物分析方法已广泛用于对生物活性物质的检测。在这些开创性的工作之后，一个重要的挑战是实现更准确可靠的定量分析。
[0003]比率分析可以帮助校正复杂的基质问题并实现对生物样本的准确可靠分析。采用内标（IS）不仅可以消除样品预处理过程中的失误，而且可以校正仪器检测中的信号波动。比率分析通过两个信号的比值进行定量分析，可显着提高方法的准确性。许多研究者们也致力于有效IS的设计。尽管取得了巨大的成功，但复杂的IS标记或合成程序常常阻碍了SI在生物定量分析中的广泛应用。

技术实现思路

[0004](一) 要解决的技术问题为了实现对抗原的准确定量检测，本专利技术提供一种以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法。
[0005]本专利技术以癌胚抗原（CEA）为研究模型，磁珠为载体，金纳米颗粒为报告探针。采用高分辨电感耦合等离子体质谱（ICPMS）同时采集磁珠内的
57
Fe信号及报告探针中的
197
Au信号。研究
197
Au/
57
Fe信号比值和CEA浓度的关系，实现对CEA的准确定量分析，并提高该免疫分析方法的准确性和可靠性。
[0006](二)技术方案为了解决上述问题，本专利技术的第一目的是提供以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法实现对CEA的准确定量检测。本专利技术开发载体磁珠的一种新功能，提供了一种新型的免疫分析方法，并实现了对CEA的定量检测。其原理见图1，本专利技术以癌胚抗原（CEA）为研究模型，磁珠为载体，金纳米颗粒为报告探针。首先分别用一抗和二抗标记磁珠和金纳米颗粒。其次让其与不同浓度的CEA发生免疫反应。最后磁分离洗涤后，采用高分辨电感耦合等离子体质谱（ICPMS）同时采集磁珠内的
57
Fe信号及报告探针中的
197
Au信号。
197
Au/
57
Fe信号比值与CEA浓度在一定范围具有较
好的线性关系可实现目标分子的定量检测，并提高该免疫分析方法的准确性和可靠性。
[0007]本专利技术的检测方法优选的技术方案包括如下步骤：S1：通过常用的柠檬酸钠还原法合成金纳米粒子；S2：金纳米颗粒与一定量的抗体在室温下旋转孵育40分钟形成抗体修饰的金纳米颗粒（Ab
2-AuNPs），并用BSA封闭；S3：制备CEA抗体修饰的磁性微球（Ab
1-MMP）；S4：加入相同体积不同浓度的CEA与所述Ab
1-MMP混合，在一定温度下反应一定时间，磁性分离洗涤；S5：加入一定倍数稀释的Ab
2-AuNPs，识别CEA抗原并形成三明治结构；S6：磁性分离洗涤后，用王水消解，最后溶液被稀释至一定体积；S7：无机元素质谱采集溶液中的
197
Au与 57
Fe的信号强度并研究其比值与CEA浓度的关系。
[0008]本专利技术方法中，S2所述抗体的用量为0-20
ꢀµ
g。
[0009]本专利技术方法中，S3所述制备方法：首先，将购买的磁珠置于涡旋混合仪上涡旋30 s使磁珠重悬于瓶中。随后，取洗涤2次后的100 μL 10 mg/mL链霉亲和素包被的磁珠溶液与中加入20 μL 1 mg/mL的生物素修饰的CEA抗体（0.01 M PBS，pH 7.4），在25
ꢀº
C、1500 rpm条件下震荡孵育1 h。
[0010]本专利技术方法中，S4所述CEA浓度范围为0.6-300 ng/mL，反应温度为37
º
C，反应时间为30-90分钟，反应的缓冲为PBS pH 7.4。
[0011]本专利技术方法中，S5所述Ab
2-AuNPs的倍数稀释最优为5倍，反应温度为37
º
C，反应时间为30-90分钟，反应的缓冲为PBS pH 7.4。
[0012]本专利技术方法中，S6所述反应内容为：磁珠复合物与50 μL王水反应20 min后，用超纯水稀释溶液至8 mL。
[0013](三)有益效果本专利技术的有益效果是：1.本专利技术中以商业化的磁性微球中Fe元素作为内标，进一步提高方法的准确性，可以避免因磁珠损失造成的不准确，从而实现CEA的准确定量分析。
[0014]2.本专利技术使用磁性微粒作为载体，不需要额外加入元素或者引入另一种标记物，方法简单。
[0015]3.本专利技术的方法具有普遍适用性，本专利技术可能为基于磁珠的生物分析方法提供了新思路。
附图说明
[0016]图1 为本专利技术的实验机理示意图。
[0017]图2 为探究本专利技术中用于修饰金纳米颗粒的抗体的最佳用量优化结果图。
[0018]图3 为本专利技术中Ab
1-MPs与抗原反应时间优化的结果图。
[0019]图4 为本专利技术中Ab
2-AuNPs与抗原反应时间优化的结果图。
[0020]图5 为本专利技术分析方法对CEA检测的分析性能示意图。
具体实施方式
[0021]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0022]本专利技术为以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法实现对CEA的准确定量检测。进一步的，所述链霉亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的抗体结合形成Ab
1-MPs。
[0023]进一步的，所述合成的Ab
2-AuNPs用BSA封闭。
[0024]本专利技术用于CEA检测，包括以下步骤：S1：制备Ab
1-MPs。
[0025]S2：制备Ab
2-AuNPs。
[0026]S3：取40 μL 稀释后的Ab
1-MMP和100 μL不同浓度的CEA混合均匀，在37
ꢀº
C、1500 rpm条件下震荡孵育1 h。
[0027]S4: 用50 μL PBST溶液洗涤磁珠复合物2次。然后，向样品中加入50 μL 稀释后的Ab
2-AuNPs，在37
ꢀº
C、1500 rpm条件下震荡孵育1 h。
[0028]S5: 最后，洗涤后磁珠复合物与50 μL王水反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法，其特征在于，可用于抗原的定量检测。2.如权利要求1所述的比率免疫分析方法，其特征在于：所述比率免疫分析方法，以磁珠作为载体，金纳米颗粒作为报告探针。3.如权利要求1所述的比率免疫分析方法，其特征在于：该方法主要是CEA抗体修饰的磁性微球（Ab
1-MMP）、CEA抗原、CEA抗体修饰的金纳米颗粒（Ab
2-AuNPs）的免疫反应。4.如权利要求1所述的比率免疫分析方法，其特征在于：采用高分辨电感耦合等离子体质谱（ICPMS）同时采集磁珠内的
57
Fe信号及报告探针中的
197
Au信号；
197
Au/
57
Fe信号比值实现对CEA的准确定量分析。5.如权利要求3所述的Ab
1-MMP，其特征在于：利用链霉亲和素与生物素的特异性结合偶联抗体与磁性微球。6.如权利要求3所述的Ab
2-AuNPs，其特征在于：Ab
2-AuNPs...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕弋，王超群，刘睿，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：