以p16和MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒及其判读方法技术

本发明专利技术属于体外诊断医疗器械技术领域，具体公开了一种以p16和MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒，包括p16/MCM2一抗工作混合液、羊抗鼠/兔二抗工作混合液、DAB工作混合液、RED工作混合液和苏木素。本发明专利技术还公开了上述检测试剂盒的判读方法，采用本发明专利技术提供的宫颈癌检测试剂盒及其判读方法进行子宫颈癌及癌前病变风险评估，可以精准地进行III级风险评估，亦可以精准地给予相对应的三层风险管理，可以同时应用于准确初筛和精准分流，灵敏度高，准确率高，阳性预测值增加，是精准的筛查方法。是精准的筛查方法。是精准的筛查方法。

【技术实现步骤摘要】
以p16和MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒及其判读方法


[0001]本专利技术属于体外诊断医疗器械
，尤其涉及一种以p16和MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒及其判读方法。

技术介绍

[0002]近年来，中国宫颈癌发病和死亡负担严重，且呈上升趋势，宫颈癌筛选被认为是降低宫颈癌发病率和死亡率最有效措施。宫颈癌的发病与人乳头瘤病毒(HPVs)密切相关，HPVs是一种小型双链DNA病毒，特异性感染上皮细胞，HPV家族包含约200多种病毒亚型，每种病毒亚型的组织特异性不同，大多数HPV亚型引起的病变为良性，只有少部分HPV亚型为高危亚型，可引起肿瘤。
[0003]宫颈癌及癌前病变筛查包括三个阶段，分别为子宫颈细胞学筛查(初诊)、阴道镜检(转诊)和子宫颈活检组织病理学(确诊)。
[0004]其中，子宫颈细胞学筛查需遵循以下两项基本原则：即尽可能减少高级别病变及以上(HSIL，高度的鳞状上皮内病变，CINII
+
)的漏筛和漏检(随访复查和常规筛查)的同时，亦尽可能减少低级别病变及以下(LSIL，鳞状上皮低密度病变，CINI
‑
)的过度筛查(阴道镜检)。子宫颈细胞学筛查经历了三个以下阶段的演变：
[0005]阶段一、(1)采用巴氏涂片法(CPS)进行初诊，具体是在宫颈移行带取材、涂片和巴氏染色，在显微镜下观察细胞形态学改变的一种方法，其诊断标准分为五级：巴氏Ⅰ级
‑
正常、巴氏Ⅱ级
‑
炎症。巴氏Ⅲ级
‑
可疑癌；巴氏Ⅳ级
‑
高度可疑癌；巴氏
Ⅴ
级
‑
癌。这种诊断方法虽然便宜，便于普查，但是由于细胞堆积在一起，不便于观察，准确率低。
[0006](2)LBC(液基细胞学检测)：用特制的小毛刷沿宫颈表面和宫颈管刷几圈，收集到的细胞经计算处理称为单层排列的细胞，诊断准确率高，对设备和技术的要求较高，价格偏贵。诊断标准大致分为：感染、反应性改变、上皮细胞异常(如不典型鳞状上皮细胞、低度或鳞状上皮内病变、鳞状细胞癌、不典型腺细胞、宫颈腺癌等)。
[0007]阶段二、病因生物标记物；
[0008](1)检测核酸，包括HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA；(2)检测蛋白，包括HPV L1壳蛋白和HPV E6/E7蛋白。HPV的晚期基因区(L)位于HPV DNA序列的下游，含有两个开放阅读框架，其中HPV L1编码的HPV L1壳蛋白是HPV的主要衣壳蛋白。
[0009]阶段三、病变生物标记物；
[0010](1)检测核酸：包括DNA倍体、人类染色体末端酶RNA基因(hTERC)和DNA甲基化。(2)检测蛋白：包括以p16、MCM2为靶标的免疫细胞化学染色法(Immunocytochemistry，ICC)。
[0011]p16基因又名多肿瘤抑癌基因(multiple tumor suppressor 1，MTS)，其在细胞核和细胞浆中表达的抑癌蛋白p16是细胞周期进展负调节蛋白。当人乳头瘤病毒整合感染宫颈上皮细胞后，引入并激活致癌基因E7，促使致癌蛋白E7表达，抑制pRB蛋白(由抑癌基因Rb编码得到)与E2F蛋白结合，促进宫颈上皮细胞增殖。当细胞增殖过度，将激活细胞增殖负反馈调节机制，即通过激活抑癌基因p16，促使抑癌蛋白p16表达，促进pRB与E2F蛋白结合，从
而抑制宫颈上皮细胞过度增殖。
[0012]微小染色体维持蛋白(minichromosome maintenance protein，MCM)是真核生物DNA复制的主要调控因子之一，其家族成员MCM2被认为是特异性增殖相关因子。MCM2为细胞周期S期异常的分子标记物，当人乳头瘤病毒整合感染宫颈上皮细胞后，引入并激活致癌基因E6和E7，促使致癌蛋白E6和E7表达，致使宫颈上皮细胞G1期向S期过渡受限。
[0013]现有免疫细胞化学单染色检测，仅检测细胞是否产生阳性染色，检测不全面。有的判读方法以多个靶标检测后，将出现两个以上阳性细胞作为阳性，从而产生大量的假阳性，或漏诊的现象，失去了辅助诊断的意义。有的判定方法过于草率，如多个靶标中，只要出现两个以上靶标染色显示阳性，则判定为高风险，会造成大量的过度筛查。故有必要对于多染的细胞免疫化学染色的判读方法，进一步的探索和确认。

技术实现思路

[0014]本专利技术的目的在于提供一种以p16和MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒及其判读方法，以至少解决上述技术问题之一。
[0015]本专利技术的目的之一在于提供：以p16和MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒，包括p16/MCM2一抗工作混合液、羊抗鼠/兔二抗工作混合液、DAB工作混合液、RED工作混合液和苏木素。
[0016]本专利技术目的之二在于提供：上述宫颈癌检测试剂盒的判读方法，宫颈细胞采样后制备一张子宫颈细胞制片；
[0017]采用p16/MCM2一抗工作混合液、羊抗鼠/兔二抗工作混合液、DAB工作混合液、苏木素对细胞制片进行p16/MCM2免疫组织化学染色。
[0018]结合染色结果、细胞数量和细胞核面积，得出判定结果，具体如下表所示：
[0019][0020][0021]优选地，配制p16/MCM2一抗工作混合液：首先将抗体稀释液和p16一抗浓缩液混合，再加入到MCM2一抗浓缩液中混匀。
[0022]优选地，配制羊抗鼠/兔二抗工作混合液：将羊抗鼠二抗工作液加入羊抗兔二抗工作液中混合。
[0023]优选地，配制DAB工作混合液：DAB染色底物和DAB染色缓冲液混匀得到。
[0024]优选地，配制RED工作混合液：AP
‑
red显色缓冲液和AP
‑
red色原浓缩液混匀得到。
[0025]优选地，对细胞制片进行p16/MCM2免疫组织化学染色：首先将p16/MCM2一抗工作混合液添加到细胞制片上；然后在细胞制片上再羊抗鼠/兔二抗工作混合液，最后依次添加DAB工作混合液、RED工作混合液和苏木素进行染色。
[0026]本专利技术有益效果在于：
[0027](1)本专利技术提供的试剂盒通过免疫细胞化学法检测p16和MCM2蛋白表达，进行子宫颈癌及癌前病变风险评估，是一种新型的子宫颈癌及癌前病变筛查方法。高敏感靶标MCM2可作为新一代子宫颈癌及癌前病变筛查“初筛”指标；通过p16/MCM2双染保证了其特异性(特异性与TCT宫颈癌筛查相当)，通过MCM2单染又保证了其敏感性(敏感性与HPV病毒学检查相当)，是高特异性和高敏感性兼具的宫颈癌筛查方法。
[0028](2)本专利技术提供的试剂盒判读方法，既结合了客观的子宫颈癌及癌前病变生物标记物指标p16、MCM2，亦引入了细胞形态学主观判定方法(参考TBS指南对于LSIL(鳞状上皮低密度病变)/ASC
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US(意义不明的不典型鳞状细胞)的形态学判读)，染色结果直观，判读简便，不局限于专业细胞病理医生阅片，普通医本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.以p16和MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒，其特征在于，包括p16/MCM2一抗工作混合液、羊抗鼠/兔二抗工作混合液、DAB工作混合液、RED工作混合液和苏木素。2.根据权利要求1所述的以p16和MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒，其特征在于，p16/MCM2一抗工作混合液包括抗体稀释液、p16一抗浓缩液和MCM2一抗浓缩液；羊抗鼠/兔二抗工作混合液包括羊抗鼠二抗工作液和羊抗兔二抗工作液；DAB工作混合液包括DAB染色底物和DAB染色缓冲液；RED工作混合液包括AP
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red显色缓冲液和AP
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red色原浓缩液。3.根据权利要求1或2所述的以p16和MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒的判读方法，其特征在于，制备子宫颈脱落细胞制片；采用p16/MCM2一抗工作混合液、羊抗鼠/兔二抗工作混合液、DAB工作混合液、RED工作混合液、苏木素对细胞制片进行p16/MCM2免疫组织化学染色；结合染色结果、细胞数量和细胞核面积，得出判定结果，如表所示。4.根据权利要求3所述的以p16和MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒的判读方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：李克强，姚远颋，许舟，顾重建，
申请(专利权)人：重庆沃康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：